[科普中國]-水蛭素

水蛭素（Hirudin）是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多種活性成分中活性最顯著并且研究得最多的一種成分，它是由65—66個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)（多肽）。水蛭含有豐富的水蛭素，水蛭素對凝血酶有極強(qiáng)的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑。 水蛭素具有極強(qiáng)的抑制凝血作用和抗血栓形成作用,在臨床治療和預(yù)防各種血栓形成方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

介紹水蛭屬于高度特化的環(huán)節(jié)動(dòng)物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，俗稱螞蝗，是我國傳統(tǒng)的中藥，味咸、苦,性平?！吨腥A人民共和國藥典》載具有破血、逐瘀、通經(jīng)之療效,主要用于治療瘤癥、痞塊、血瘀、閉經(jīng)和跌打損傷。1884年，Haycraft首次在歐洲醫(yī)用水蛭的唾液腺里發(fā)現(xiàn)了一種生物活性物質(zhì)水蛭素;1927年,Shionoya最先把它作為抗血栓的有效藥物來進(jìn)行研究;1955Markwardt指出其為蛋白物質(zhì)，并命名為水蛭素。天然水蛭素是從醫(yī)用水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質(zhì)，是由65個(gè)或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,相對分子質(zhì)量為7000Dalton。水蛭素的N末端有3對二硫鍵,使N末端肽鏈繞疊成密集的環(huán)肽結(jié)構(gòu)，對蛋白結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。其N末端含活性中心，能識(shí)別底物即凝血酶堿性氨基酸富集位點(diǎn),并與之結(jié)合。C末端富含酸性氨基酸殘基,最后9個(gè)氨基酸中有6個(gè)為酸性氨基酸。1

水蛭素肽鏈中部有一個(gè)由Pro-Lys-Pro組成的特殊序列,不被一般蛋白酶降解,這一結(jié)構(gòu)有2個(gè)方面的作用:①維持水蛭素分子的穩(wěn)定性;②引導(dǎo)水蛭素分子以正確的方向與凝血酶分子結(jié)合。1

水蛭素作用于凝血酶的原理一系列酶促級聯(lián)放大反應(yīng)在內(nèi)源性和外源性凝血過程中使凝血酶原活化,生成凝血酶。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,在血栓形成過程中起非常關(guān)鍵的作用，包括血凝過程的級聯(lián)反應(yīng)、纖維蛋白沉積和血小板活化等?？鼓种苿┛煞譃殚g接凝血酶抑制劑和直接抗凝血酶抑制劑。前者是通過催化凝血酶的天然抑制劑( AT III或肝素輔助因子II)而產(chǎn)生抗凝作用。而水蛭素是特異性凝血酶抑制劑，能與凝血酶直接結(jié)合,其抗凝作用不依賴AT III或肝素輔助因子II ,屬直接凝血酶抑制劑。水蛭素通過作用于凝血酶的非活性底物識(shí)別位點(diǎn)和酶活性中心2個(gè)位點(diǎn),與凝血酶1：1結(jié)合形成不可逆的復(fù)合物,從而使凝血酶失去作用。水蛭素的抗凝作用不但專一,而且其抗凝活性明顯強(qiáng)于肝素。此外,水蛭素不僅能抑制血漿中游離的凝血酶。1

作用動(dòng)物試驗(yàn)與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等進(jìn)一步血瘀現(xiàn)象。此外，它還能抑制凝血酶誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖和凝血酶對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會(huì)引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子；而肝素則有引起出血的危險(xiǎn)，在彌漫性血管內(nèi)凝血的發(fā)病過程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，采用水蛭會(huì)有較好的效果。

信息介紹

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應(yīng)用水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動(dòng)脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環(huán)和血液透析過程。在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛咸幯芩ㄈ鴮?dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，已證明有療效的腫瘤如纖維肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學(xué)治療和放射治療，由于促進(jìn)腫瘤中的血流而增強(qiáng)療效。

動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，無論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，對血壓、心率、血相、出血時(shí)間和血液化學(xué)成分均不受影響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無過敏反應(yīng)，一般無特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量LD50>50mgAg，遠(yuǎn)大于治療所用的劑量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來很大方便。水蛭素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，這就可以解釋為何口服中藥水蛭提取液仍然有療效的原理。

其年產(chǎn)值達(dá)數(shù)千萬元。含水蛭的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程生產(chǎn)重組水蛭類多肽藥物，以取代水蛭素或作為抗凝化瘀藥的添加成分，則還需要進(jìn)一步的臨床研究。毋庸置疑，重組水蛭素類多肽藥物的開發(fā)將會(huì)帶來巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

藥理作用天然水蛭素是一種從吸血類水蛭唾液腺及其分泌液中提取的天然活性物質(zhì)，而重組水蛭素則是通過基因工程獲得的人工產(chǎn)品。重組水蛭素的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與天然水蛭素唯一不同的是其在63位酪氨酸殘基未硫酸化，該特點(diǎn)使其對凝血酶的抑制作用明顯降低，僅為天然水蛭素的1/10。重組水蛭素在藥理活性、藥代動(dòng)力學(xué)方面與天然水蛭素非常相似。

由于多種原因，世界上對天然水蛭素的藥理學(xué)和臨床研究嚴(yán)重滯后，對重組水蛭素的研究也是在1986年后才陸續(xù)開始的，近十幾年來的文獻(xiàn)大多都是研究有關(guān)重組水蛭素的內(nèi)容，故在本章節(jié)的藥理學(xué)和臨床研究的內(nèi)容中收錄了重組水蛭素文獻(xiàn)資料，以佐證天然水蛭素的相關(guān)作用與應(yīng)用。

體內(nèi)外試驗(yàn)表明，水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，對各種血栓性疾病都有效。水蛭素的作用機(jī)制是它與凝血酶按1:1的比例非共價(jià)結(jié)合形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制了凝血酶的活性，從而阻止了纖維蛋白原凝固及凝血酶對血小板的作用，達(dá)到抗凝的目的，同時(shí)水蛭素的作用不依賴于抗凝血酶m，其抑制血栓形成的濃度遠(yuǎn)小于其引起1出血的濃度，無明顯毒副作用。

水蛭素具有抗凝、抗血栓、抑制血小板聚集、降血脂、改善血液流變學(xué)、抗腫瘤等多種藥理作用。

相關(guān)研究我們對重組水蛭素基因工程作了大量系統(tǒng)的研究，具有堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。我們從國內(nèi)養(yǎng)殖的醫(yī)用水蛭中克隆出水蛭素的cDNA進(jìn)行測序，并合成了大腸桿菌偏愛密碼子的水蛭素基因，構(gòu)建了分泌型大腸桿菌表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得高效表達(dá)，產(chǎn)物直接分泌至跑外，大大簡化了下游工程。我們根據(jù)水蛭素的特性，設(shè)計(jì)了適合大規(guī)模生產(chǎn)的低成本的分離純化新工藝，無需高效液相層析或反相層析，只經(jīng)三步純化，即獲得電泳純的產(chǎn)品。

重組水蛭素

由于水蛭素具有重要開發(fā)價(jià)值，而水蛭的來源有限，故國內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。1986年后，重組水蛭素已在大腸桿菌和酶母中分別表達(dá)成功，與天然水蛭素相比，重組水蛭素在第63位氨基酸（酪氨酸）上未硫酸酪化，活性略低，其余性質(zhì)基本相同。在治療的劑量下靜脈注射無毒副反應(yīng)?，F(xiàn)國外一些大的生物技術(shù)公司對水蛭素己進(jìn)入多方面的臨床研究。有關(guān)水蛭素類多肽的專利，每年公布的數(shù)量至少在十多項(xiàng)以上，包括水蛭素類似的多肽，研究論文每年總在數(shù)十篇以上。1998年底重組水蛭素藥物在德國正式上市，1999年英國批準(zhǔn)上市，己注冊的國家有美國、歐洲、澳大利亞、新西蘭、南非等10多個(gè)國家。

水蛭素在使用過程中血清半衰期太短，難以發(fā)揮抗栓效果。將水蛭素與PEG（聚乙二醇）一起加工成為耦合體制劑后可大大延長水蛭素的血清半衰期從而提高其在體內(nèi)的抗血栓生成效果----（聚乙二醇（PEG）修飾是常用的提高蛋白和多肽類藥物血漿半衰期的方法）。

發(fā)展前景心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤是主要危害人類健康的兩大類病害，防治這兩大類疾病的藥物是新藥研制的重點(diǎn)。水蛭在破血、逐瘀、通經(jīng)、消癥等方面的療效已為我國數(shù)千年中醫(yī)實(shí)踐所證明，重組水蛭素在抗凝消栓以及配合腫瘤化療和放療上的作用也為國外臨床所證明。注射針劑的要求較高，將重組水蛭素類多肽藥物取代水蛭或作為中成藥的添加成分，估計(jì)至少可獲得上億元的經(jīng)濟(jì)效益。隨著臨床試驗(yàn)的擴(kuò)大，它將可以用于更多的疾病的防治，發(fā)展前景十分廣闊。

技術(shù)比較表達(dá)水平，純化工藝，產(chǎn)品質(zhì)量與國外水平相當(dāng)，某些技術(shù)指標(biāo)超過國外，成本比國外低。

在美國，藥用重組水蛭素每毫克6美元。我國生產(chǎn)的成本低，如果每毫克降至人民幣6元，廣大患者就有可能承受得起。國外重組水蛭素都采用針劑，我們正在研制口服劑型，口服無疑更易被病人接受，成本也可更多降低。尤其是它可以拓寬使用的范圍，用于各種血栓病的防治，或作為有關(guān)藥物的主要成分或添加成分，可開發(fā)更大的市場。

需求分析在醫(yī)藥市場上，抗栓藥物的需求與日俱增，但由于天然水蛭來源有限，各國醫(yī)藥界都將注意力集中在重組水蛭素的開發(fā)上。美國、法國、瑞士、德國、英國、日本十多家生物技術(shù)公司和醫(yī)院都在臨床應(yīng)用或研究重組水蛭素類多肽抗栓藥物治療血栓疾病的范圍和療效。1998年底，德國首先上市重組水蛭素藥物。1999年英國也獲批準(zhǔn)上市。

中國具有心血管疾病藥物和腫瘤藥物的巨大市場，水蛭素又是傳統(tǒng)中藥，因此重組水蛭素開發(fā)前景十分看好。

據(jù)估計(jì)，每年共需300—500公斤。

國際上常用肝素作為抗凝藥物，這類抗凝藥物的使用已有60多年歷史，需用量逐年增加。美國70年代每年就有1000萬病人使用肝素，大部分是手術(shù)后預(yù)防血栓的形成。僅美國肝素的年用量就超過9000億單位，約相當(dāng)于6噸。研究表明，水蛭素在許多性能上都優(yōu)于肝素，它用藥量小，不引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子。

隨著臨床研究的廣泛開展，重組水蛭素的應(yīng)用范圍不斷拓寬，它的需求也會(huì)日益增大。

優(yōu)點(diǎn)第一，水蛭素與水蛭肽抑制凝血酶的反應(yīng)不需要抗凝血酶Ⅲ(AT—Ⅲ)作為輔助因子，使其抗凝作用與量效關(guān)系更吻合，而且可在缺乏抗凝血酶Ⅲ的病人(如彌漫性血管內(nèi)凝血)中使用。

第二，肝素不能滅活結(jié)和于血栓上的凝血酶。而水蛭素與水蛭肽則對循環(huán)中的和結(jié)合于血栓上的凝血酶都可以抑制。

第三，肝素會(huì)被激活的血小板釋放的血小板因子4(PTF4)或富含組氨基酸的糖蛋白等結(jié)合，水蛭素與水蛭肽則不受這些因素的影響。

第四，水蛭素與水蛭肽用于抗血栓治療，出血副作用較小，且無過敏反應(yīng)和免疫原性無毒反應(yīng)。

結(jié)構(gòu)原理天然水蛭素是由65或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為7000，能在極端的pH和熱條件下穩(wěn)定存在。水蛭素的形狀類似蝌蚪，蝌蚪頭部是多肽的N端，富含半胱氨酸（cys），半胱氨酸間相互作用形成3個(gè)二硫鍵（Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys22-Cys39）使N末端結(jié)構(gòu)緊密；蝌蚪尾部是含有多個(gè)酸性氨基酸和一個(gè)被磺酸化的酪氨酸（Tyr63）的多肽C末端。凝血酶（thrombin）是血液凝固和止血過程中的中心酶，它不但能剪切纖維蛋白原，將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白；還能激活其它的凝固血液的酶類，如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C（Fenton，1981）等。凝血酶與大分子底物的相互作用取決于三個(gè)不同的區(qū)域：催化反應(yīng)位點(diǎn)的初級結(jié)合位C（Magnusen，1971），鄰近催化位點(diǎn)的非極性結(jié)合位點(diǎn)AB（Brlinr and Shen，1977；Sonder and Fenton，1984）和負(fù)責(zé)凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰離子結(jié)合位點(diǎn)（識(shí)別位點(diǎn)）R（Fenton et al.1989；Henriksen and Mann，1988）。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位點(diǎn)，其疏水結(jié)構(gòu)域與凝血酶的非極性結(jié)合位點(diǎn)（AB）互補(bǔ)；該非極性結(jié)合位點(diǎn)靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6個(gè)酸性氨酸，能與帶正電的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)形成許多離子鍵。N端、C端兩個(gè)功能域以協(xié)同的方式結(jié)合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一個(gè)帽子，阻止底物的結(jié)合。

為了更好地了解水蛭素結(jié)構(gòu)對性能的影響，人們對于水蛭素的N端、C端和各位點(diǎn)做了大量研究，得出許多結(jié)論，為水蛭肽的設(shè)計(jì)打了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。各種研究表明水蛭素C末端的10個(gè)氨基酸是必需的最小結(jié)構(gòu)，C末端的最佳大小至少是12個(gè)氨基酸（Hir54-65），在這一序列中每個(gè)氨基酸都非常重要。幾個(gè)疏水殘基和酸性殘基對于維持水蛭素C末端的功能非常重要。

區(qū)別1.水蛭素，主要是從吸血水蛭的唾液中分離提純出來，具有抗凝，抗血栓功效的多肽物質(zhì)，臨床常用于多重血栓性疾病的治療，可以消除血管阻塞，使血細(xì)胞解聚，血栓消散，促進(jìn)微血管復(fù)通，消除脂肪肝，直接溶化血栓，消除動(dòng)脈粥樣硬化，防止中風(fēng)和再次中風(fēng)，激活人體自身的溶栓功能，避免再次產(chǎn)生溶栓等。

2.制水蛭是將水蛭洗干凈，晾干，用滑石粉熱炒，炒至水蛭鼓起，篩去滑石粉，粉碎，就得到水蛭藥粉了，具有通經(jīng)，破瘀消腫的功效，主要用于月經(jīng)閉止，癥瘕腹痛，蓄血，跌打損傷，淤血作痛，癰腫丹毒等癥的治療。

從上述水蛭素和水蛭的功效來看，顯然水蛭素對中風(fēng)的效果比制水蛭好。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

張磊 - 副教授 - 重慶師范大學(xué)