[科普中國]-流式細(xì)胞DNA分析

流式細(xì)胞DNA分析是可以研究間期細(xì)胞，并不受細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響，對檢測胸腔積液中的惡性細(xì)胞的有重要意義的一種檢查方法。 流式細(xì)胞儀的檢測范圍： (1) 流式細(xì)胞儀可以檢測細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括：細(xì)胞大小、細(xì)胞粒度、細(xì)胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細(xì)胞周期、RNA 含量、蛋白質(zhì)含量。 (2) 流式細(xì)胞儀可以檢測細(xì)胞功能，包括：細(xì)胞表面/ 胞漿/ 核的特異性抗原、細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、酶活性、激素結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞受體。

正常值身體處于動(dòng)態(tài)平衡中，沒有疾病。

臨床意義流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用： (1) 流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用：流式細(xì)胞術(shù)可以檢測腫瘤細(xì)胞增殖周期、檢測腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記、癌基因表達(dá)產(chǎn)物、進(jìn)行多藥耐藥性分析、檢測凋亡 (2) 流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用：檢測白血病和淋巴瘤細(xì)胞、活化血小板、造血干細(xì)胞(CD34+)計(jì)數(shù)、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測 (3) 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用：可以進(jìn)行淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞免疫分型、檢測細(xì)胞因子。異常結(jié)果：有資料表示對71例胸腔積液做流式細(xì)胞DNA分析，結(jié)果顯示，對惡性胸腔積液診斷的敏感性為52%，特異性達(dá)100%。若與常規(guī)檢查聯(lián)合應(yīng)用，則可使診斷的敏感性達(dá)到94%。癌性胸水細(xì)胞的DNA分析可見異倍體和S期、G2/M期細(xì)胞比例增高。 需要檢查的人群：疑似有癌性胸水等相關(guān)疾病者

注意事項(xiàng)流式細(xì)胞儀并非是完全自動(dòng)化的儀器，準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要準(zhǔn)確的人工技術(shù)配合，所以標(biāo)本制備需要規(guī)范，儀器本身亦需要質(zhì)量控制。 (1) 流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)檢測的影響因素和質(zhì)量控制 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，其免疫熒光染色的標(biāo)本制備非常重要，常常由于標(biāo)本制備過程中出現(xiàn)人為非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細(xì)胞濃度低等影響檢測結(jié)果。解決這些影響因素的方法如下： ① 確保標(biāo)本上機(jī)檢測前的濃度為1X106細(xì)胞/ml，細(xì)胞濃度過低直接影響檢測結(jié)果。 ② 使用蛋白封閉劑，封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，尤其在間接免疫熒光標(biāo)記時(shí)必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。 ③ 熒光抗體染色后充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細(xì)胞和細(xì)胞碎片。 ④ 設(shè)置對照樣品，采用與抗體來源同型匹配的無關(guān)對照和熒光抗體的本底對照。 ⑤ 判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意減去本底熒光，為使免疫熒光的定量分析更精確，應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序軟件，用擬合曲線方法從實(shí)驗(yàn)組的曲線峰值中減去對照組的曲線峰值，可以得到更準(zhǔn)確的免疫熒光定量結(jié)果。 ⑥ 注意染色后避光，保證細(xì)胞免疫熒光的穩(wěn)定。 (2) DNA倍體分析的質(zhì)量控制仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大，1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA 測定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我們根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合國內(nèi)有經(jīng)驗(yàn)的專家多年的實(shí)踐，對FCM的DNA分析技術(shù)的質(zhì)控和注意事項(xiàng)進(jìn)行說明。 ① 手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本或活檢針吸標(biāo)本取材時(shí)，要避免出血壞死組織。 ② 標(biāo)本采集后要及時(shí)固定或深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA 降解，而造成測試結(jié)果的誤差。 ③ 固定劑要采用對組織細(xì)胞穿透性強(qiáng)的濃度，70%的乙醇固定效果較好。 ④ 單細(xì)胞懸液制備過程中，注意將待測細(xì)胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，并注意不要損傷該群細(xì)胞。 ⑤ 細(xì)胞樣品的采集要保證足夠的細(xì)胞濃度，即1X106細(xì)胞/ml，雜質(zhì)、碎片、團(tuán)塊和重疊細(xì)胞應(yīng)8%，與腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)。另外，DNA倍體分析時(shí)，同源組織的不同個(gè)體會出現(xiàn)10%的漂移。 ④ DNA倍體標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制，采用相同個(gè)體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。

檢查過程流式細(xì)胞DNA分析：直接用可產(chǎn)生熒光的核酸染料(如碘化丙啶)對胸水中細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀分析胸水細(xì)胞的DNA含量、細(xì)胞周期分布和DNA倍體數(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)檢測時(shí)的樣品制備： (1) 直接免疫熒光標(biāo)記法 取一定量細(xì)胞(約1X106細(xì)胞/ml)，直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時(shí)加入)，孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7.2-7.4)洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機(jī)檢測。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時(shí)測定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。 (2) 間接免疫熒光標(biāo)記法 取一定量的細(xì)胞懸液(約1X106細(xì)胞/ml)，先加入特異的第一抗體，待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，以FCM檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費(fèi)用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標(biāo)本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強(qiáng)，易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以標(biāo)本制備時(shí)應(yīng)加入陰性或陽性對照。另外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。

相關(guān)疾病DNA，局限性胸膜間皮瘤，類肺炎性胸腔積液，結(jié)核性胸膜炎，小兒苯丙酮尿癥等。

相關(guān)癥狀胸水，肺癌胸水，惡性胸水，血性胸水，滲出性胸水等。

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本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

曹水江 - 副主任醫(yī)師 - 長征醫(yī)院南京分院 普通外科