[科普中國]-共聚焦激光掃描顯微

共聚焦激光掃描顯微（英語：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一項高分辨率三維光學成像技術。主要特點在于其光學分層能力，即獲得特定深度下焦點內的圖像。圖像通過逐點采集，以及之后的計算機重構而成。因此它可以重建拓撲結構復雜的物體。

詳解共聚焦激光掃描顯微（英語：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一項高分辨率三維光學成像技術。1主要特點在于其光學分層能力，即獲得特定深度下焦點內的圖像。圖像通過逐點采集，以及之后的計算機重構而成。因此它可以重建拓撲結構復雜的物體。對于不透明樣品，可以進行表面作圖，而對于透明樣品，則可以進行內部結構成像。內部結構成像上，圖像質量在單臺顯微鏡中就可以得到極大的提升，因為來自樣品不同深度的信息未被重疊。傳統(tǒng)顯微鏡能“看”到所有能被光投身到地方，而對于共聚焦顯微鏡，只有焦點處的信息被采集。實際上共聚焦激光掃描顯微是通過對焦點深度的控制和高度限制來實現(xiàn)的。

共聚焦的原理早在1957年就由美國科學家馬文·明斯基注冊為專利，但實際上經過三十年的時間及相應專用激光器的發(fā)展，直至1980年代末這項技術才成為標準技術。1978年，托馬斯和克里斯托弗·克萊默設計出一套激光掃描程序。該程序采用激光聚焦的方式逐點掃描物體三維表面，并通過類似于掃描電鏡的計算機化手段生成圖像。這一共聚焦激光掃描顯微設計首次結合了激光掃描方法和熒光標記的生物樣品三維探測。接下來的數(shù)十年內，共聚焦熒光顯微發(fā)展成一項成熟的技術，尤其受益于阿姆斯特丹大學（University of Amsterdam），來自海德堡的歐洲分子生物實驗室（European Molecular Biology Laboratory）及其業(yè)界伙伴的共同努力。

共聚焦顯微鏡提供了完整，厚實，活體標本的直接，無創(chuàng)，連續(xù)光學切片的能力，最小化樣品制備以及橫向分辨率的微小改善。生物樣品通常用熒光染料處理，以使選定的物體可見。然而，實際的染料濃度可以很低，以最小化生物系統(tǒng)的干擾：一些儀器可以跟蹤單個熒光分子。此外，轉基因技術可以產生生成其自身熒光嵌合分子的生物（例如GFP，綠色熒光蛋白的融合體）用感興趣的蛋白質）。共聚焦顯微鏡的工作原理是樣品中的點激發(fā)（衍射極限點）和所得熒光信號的點檢測。探測器上的針孔提供了阻擋離焦熒光的物理屏障。僅記錄通風盤的對焦或中心點。光柵一次掃描一個樣本允許通過簡單地改變z焦點來收集薄的光學部分?？梢远询B所得到的圖像以產生樣本的3D圖像。

用于水平掃描的顯微技術市面上有四種類型的共焦顯微鏡：

共聚焦激光掃描顯微鏡使用多個鏡子（通常沿x軸和y軸線性掃描2或3個）來掃描樣品上的激光，并通過固定的針孔和檢測器“掃描”圖像。

旋轉盤（Nipkow盤）共焦顯微鏡在盤上使用一系列移動針孔來掃描光點。由于一系列針孔平行掃描一個區(qū)域，因此與激光掃描顯微鏡相比，允許每個針孔在特定區(qū)域上懸停更長的時間，從而減少照射樣品所需的激發(fā)能量。降低的激發(fā)能量減少了樣品的光毒性和光漂白，使其成為用于成像活細胞或生物體的優(yōu)選系統(tǒng)。

微透鏡增強或雙旋轉盤共聚焦顯微鏡的工作原理與旋轉盤共聚焦顯微鏡相同，只是在含有針孔的旋轉盤之前放置含有微透鏡的第二個旋轉盤。每個針孔都有一個相關的微透鏡。微透鏡用于捕獲寬帶光并將其聚焦到每個針孔中，從而顯著增加引入每個針孔的光量并減少旋轉盤阻擋的光量。因此，微透鏡增強型共聚焦顯微鏡比標準旋轉磁盤系統(tǒng)更敏感。橫河電機于1992年發(fā)明了這項技術。

**可編程陣列顯微鏡（PAM）**使用電子控制的空間光調制器（SLM），產生一組移動的針孔。SLM是包含像素陣列的設備，其具有可以電子調整的各個像素的一些屬性（不透明度，反射率或旋光度）。SLM包含微機電鏡或液晶組件。圖像通常由電荷耦合器件（CCD）相機獲取。

這些類共焦顯微鏡中的每一種都具有特定的優(yōu)點和缺點。大多數(shù)系統(tǒng)要么針對記錄速度（即視頻捕獲）或高空間分辨率進行了優(yōu)化。共聚焦激光掃描顯微鏡可以具有可編程的采樣密度和非常高的分辨率，而Nipkow和PAM使用由相機分辨率定義的固定采樣密度。單點激光掃描系統(tǒng)的成像幀速率通常比旋轉磁盤或PAM系統(tǒng)慢。商用旋轉盤共聚焦顯微鏡的幀速率超過每秒50幀- 這是動態(tài)觀察（如活細胞成像）的理想特征。

在實踐中，只要針孔距離足夠遠，Nipkow和PAM就允許多個針孔平行掃描同一區(qū)域。

共焦激光掃描顯微鏡的前沿開發(fā)現(xiàn)在通過使用多個微機電掃描鏡，可以比標準視頻速率（每秒60幀）成像更好。

共聚焦X射線熒光成像是一種較新的技術，除了水平和垂直瞄準外，還可以控制深度，例如，在分析繪畫中的埋藏層時。

本詞條內容貢獻者為:

劉軍 - 副研究員 - 中國科學院工程熱物理研究所