[科普中國]-肽核酸芯片

芯片的載體的預(yù)處理

芯片制備之前要對載體進(jìn)行修飾，使其表面有可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性基團(tuán)，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)，并使載體具有良好的穩(wěn)定性和生物兼容性。對支持物進(jìn)行表面處理的原因有兩方面。首先，支持物表面上要有一種合適的功能基團(tuán)以連接探針，并使探針穩(wěn)定地固定于支持物表面，以防止雜交后清洗時被洗脫。經(jīng)處理后其表面衍生出氨基、醛基、異硫氰酸基及環(huán)氧基團(tuán)。這些活性基團(tuán)可與DNA分子中的磷酸基、氨基、羥基等基團(tuán)形成離子鍵或共價結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固定在支持物表面。其次，支持物表面經(jīng)處理后．可減少親水性探針在其表面的擴(kuò)散，因而提高了點陣密度。

基因芯片的制作方法基因芯片的制作一般有兩種方法，一種為原位合成(insitusynthesis)．適用于寡核苷酸；一種為合成后交聯(lián)(post—synthetic attachment)也叫點樣法。

①原位合成法。此方法制作的芯片常被稱作DNA芯片，即在芯片上原位合成寡核苷酸探針，合成的探針被直接有序地固化于支持物上，以用于雜交分析。原位合成法制備的芯片是高密度的，核酸探針長度較短，最適用于DNA再測序、查明點突變，以及基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析等。

光導(dǎo)原位合成法是常用的原位合成法，它是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子(linker)，其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去。用特制的光欄(light mask)(光刻掩膜，photoliographic mask)保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位。在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其他位點加上另外3種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個核苷酸長的芯片需要有4N個步驟。每一獨特序列的探針稱為一個“feature”．這樣的芯片便具有4N個“feature”(探針位點，每個探針位點含有幾百萬個相同的探針)，包含了全部長度為N的核苷酸序列。這種原位合成的方法無需制備處理克隆和產(chǎn)物。運用這種方法制作的芯片探針間隔為5～10μm，密度可高達(dá)106探針/cm2。該方法的優(yōu)點在于合成速度快、步驟少、合成探針陣列量大；缺點是合成反應(yīng)產(chǎn)率較低，不到95%，探針長度較短，一般為2～8 bp。此外，如果每步去保護(hù)不徹底會導(dǎo)致雜交信號模糊，信噪比減低。為此，有人用電子射線和酸作為去保護(hù)劑以提高產(chǎn)率及點陣密度。

②點樣法。點樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機(jī)器人直接點在芯片上，然后經(jīng)過紫外線照射或Schiff堿連接法固定、變性、沖洗和晾干而成。以此方法制作的芯片也被稱為微點陣(microarray)，可將較大的核酸片段(大于100 bp)物理地固定在介質(zhì)上。該方法的探針制備是在芯片以外采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得的，如PCR、分子克隆、人工合成DNA片段等。將制備好的探針通過手工或自動點樣裝置點在經(jīng)特殊處理的載玻片或其他材料上即可，主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。探針可以是合成的短寡核苷酸片段，也可以是從基因組中制備的基因片段或cDNA；可以是雙鏈，亦可采用單鏈的DNA或RNA片段。也有人用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA，一類DNA類似物，以氨基酸取代糖磷酸主鏈)制成探針。

樣品制備及樣品的標(biāo)記方法樣品的制備和標(biāo)記是基因芯片實驗流程的一個重要環(huán)節(jié)，待分析基因一般不能與芯片探針直接雜交，在雜交之前必須進(jìn)行分離、擴(kuò)增和標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量和分析目的不同，采取的基因分離、擴(kuò)增和標(biāo)記的方法不同。常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增和標(biāo)記技術(shù)完全可以采用。樣品的標(biāo)記方法有放射性核素標(biāo)記法及熒光色素法等。放射性核素標(biāo)記法中33P dCTP是首選的放射性標(biāo)記物。因為其放射能量較大，尤其是在芯片上各個探針的物理距離較近時，雜交信號強(qiáng)的位點容易影響到鄰近的雜交信號弱的位點的情況下，選用33P dCTP可以更好地檢測出雜交信號弱的位點的信息。除了33P外．其他的放射性標(biāo)記物還有3H、14C、35S等。放射性核素標(biāo)記物的缺點是其放射污染。

熒光色素法中最常用的是Cye3一dUTP和Cye5一dUTP。其優(yōu)點是和逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有很好的結(jié)合性能、好的光穩(wěn)定性以及它們的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜范圍差別較大，使得光學(xué)檢測時分辨率較強(qiáng)。另外比放射性核素還有一個明顯的優(yōu)點就是能夠避免放射污染。但是信號較弱，易受背景噪聲的干擾，尤其是當(dāng)待測物質(zhì)的量較少時，檢測的敏感性不佳。

生物分子雜交反應(yīng)基因芯片與檢測基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，但雜交條件的選擇需考慮多方面的因素，如雜交反應(yīng)體系中鹽濃度，探針的濃度、GC含量、所帶電荷、序列組成，檢測基因序列的濃度，探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結(jié)構(gòu)以及雜交的時間、溫度、芯片的類型等因素。如用于基因表達(dá)檢測，需要長歷時、低溫和高鹽條件的較嚴(yán)謹(jǐn)性雜交，而用于突變檢測則需要短歷時、高溫和低鹽條件高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交。由于基因芯片影響因素很多，所以要合理設(shè)置異種核酸平行實驗、核酸質(zhì)量、檢測對照、封閉對照、歸整化對照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

最近，為提高芯片雜交的準(zhǔn)確性，出現(xiàn)了肽核酸芯片(peptide nucleic acid miroarray，PNAmicroarray)，PNA與互補(bǔ)的DNA或RNA雜交時，比類似的DNA寡聚物有著更高的親和性，而且PNA很穩(wěn)定，對提高基因芯片的檢測效果，防止假陽性方面有一定的進(jìn)步。

雜交反應(yīng)的信號檢測及分析芯片經(jīng)雜交反應(yīng)后，各反應(yīng)點形成強(qiáng)弱不同的光信號圖像，用芯片掃描儀和相關(guān)軟件加以分析，即可獲得有關(guān)的生物信息。如果是用同位素標(biāo)記樣品，其后的信號檢測即是放射自顯影，通過放射自顯影顯示雜交信號的強(qiáng)弱與分布；若用熒光標(biāo)記，則需要一套熒光掃描及分析系統(tǒng)，對相應(yīng)探針陣列上的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析比較，經(jīng)計算機(jī)軟件如Genepix 3.0軟件ImaGene 3.0軟件分析，將圖像數(shù)字化，即可獲得有關(guān)的生物信息。

目前，用于芯片的熒光信號掃描和定量分析方法主要有兩種：①利用電荷耦合裝置(charge—coupled devices，CCD)檢測的攝像系統(tǒng)；②利用激光共聚焦原理基于光電倍增管(photomulti—plier tube，PMT)檢測的掃描系統(tǒng)。由于基因芯片獲取的信息量大．所以對基因芯片雜交數(shù)據(jù)的分析、處理、查詢、比較等需要一個標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)格式。目前，一個大型的基因芯片的數(shù)據(jù)庫正在構(gòu)建中，若能將各實驗室獲得的基因芯片的結(jié)果集中起來，那么今后對數(shù)據(jù)的交流及結(jié)果的評估與分析將非常有利。近年來還發(fā)展了多種檢測方法，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等1。