[科普中國]-反相固相萃取

固相萃取

固相萃取是利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相萃取分離原理，即生物樣品通過含有吸附劑的固定相，保留其中某一組分，再選用適當?shù)娜軇┫慈ルs質(zhì)，然后用少量洗脫液迅速洗脫，從而達到分離、凈化與濃縮的目的。這要求待測物質(zhì)與固定相之間的作用力要大于待測物質(zhì)與基質(zhì)之間的作用力。待測分子與固定相之間的作用力包括：偶極、靜電引力、氫鍵、離子鍵、范德華力等，有時也利用尺寸排阻。即使SPE具有較高的選擇性，也不能完全去除雜質(zhì)的干擾，因此后來又出現(xiàn)固相微萃取(SPME)、分子印記聚合物、盤狀SPE(SPEC)及復合模式的SPE等。新近發(fā)展的固相萃取不但提高了選擇性，而且加大了流速，縮短了分析時間，易于自動化。

反相固相萃取反相固相萃取是使用非極性的固定相，在樣品或吸附劑上增加離子對試劑，有助于用反相萃取分離強極性物質(zhì)。在R-P的SPE中，有機分子吸附劑是通過-si-o-si-c鍵合到硅氧烷膠體上1個氧原子與si鍵合叫做monfunction，3個氧原子與si鍵合叫做trifunction，后者對酸性物質(zhì)有較強的耐受力。目前用得最廣泛的鍵合固定相有C18[octadecasi/y/ODS(CH2)17CH3]、C8[octy/(CH2)7CH3]吸附劑，另外還有環(huán)己烷基、丙基、乙基、甲基、苯基1。由于硅膠衍生不完全，有-OH暴露在硅膠表面，當pH> 2.0時，硅膠表面的-OH與樣品中其他離子作用會干擾待測物的吸附。后來有人用硅烷基取代硅膠表面的-OH，叫做end-capp-ing。這樣就有效地避免了由-OH帶來的干擾。近來又有人合成了疏水的N-vinylprrolidone和親脂的二乙烯氮苯混合吸附劑，提供了疏水和親脂的平衡，這種吸附劑不需要預(yù)處理，而且即使吸附劑干燥也不影響萃取效果，這種材料在制藥業(yè)已得到廣泛使用。

反相固相萃取在獸藥檢測中應(yīng)用填料硅膠表面的親水硅醇基通過硅烷化學反應(yīng)，鍵合非極性烷基或芳香基、聚合物等材料作為反相固定相，被測物的碳氫鍵與固定相表面官能團產(chǎn)生非極性的范德華力或色散力，使得極性溶劑中的非極性以及弱極性的物質(zhì)保留在固定相上，達到凈化、富集樣品的目的。大多數(shù)獸藥屬于極性或弱極性的化合物，對于強極性藥物可以通過加入離子對試劑的方法，使目標物成為穩(wěn)定離子對用于反相萃取，弱極性藥物可以通過調(diào)節(jié)pH、改變?nèi)軇┙M成的方法使藥物殘留處在分子狀態(tài)，減小其極性低在反相中保留。反相萃取中洗脫液常用甲醇、異丙醇、乙酸乙酯、正已烷等有機溶劑，試驗時可根據(jù)實際情況進行選擇。Leitner A等采用聚苯乙烯填料固相萃取柱Li Chrolut EN凈化動物組織中四種硝基呋喃類代謝物，用洗脫強度為0.45乙酸乙酯洗脫分析物，該凈化方法回收率在92%～ 105%之間，4種代謝物的測定低限0.5 ng/g～ 5 ng/g，中性環(huán)境中的硝基呋喃類代謝物凈化常用反相固相萃取法。Heller D N等測定雞蛋中16種磺胺類藥物，C18固相萃取凈化，乙腈洗脫殘留藥物，樣品的測定低限為5 ng/g～ 10 ng/g，通過對比氨基柱和C18柱，氨基柱回收率60%以下。Hirsch R等用C18柱測定水中18種抗生素，被測物回收率60%～ 91%，但是此凈化方法不能用于測定四環(huán)素類抗生素，因為四環(huán)素在EDTA水溶液中產(chǎn)生不可逆吸收2。

固相萃取方法的選擇固相萃取技術(shù)的分離模式有多種，具體使用哪種方法，主要取決于待處理樣品的相對分子質(zhì)量(Mr)及樣品的性質(zhì)。

1.選擇固相萃取應(yīng)考慮的問題：(1)待測物的化學性質(zhì)：功能基團、能否離子化，是水溶性還是脂溶性。(2)基質(zhì)的性質(zhì)：pH值、離子強度、是水還是有機溶劑。(3)類似干擾物的性質(zhì)。(4)待測物在樣品中的濃度。(5)分析的檢測限及靈敏度。(6)待測物是否需要富集、純化。2.固定相的選擇(根據(jù)相似相溶原則來選擇固定相)：SPE的固定相是樣品分離、純化的關(guān)鍵，由于固定相關(guān)系到SPE的重復性、回收率、靈敏度、特異性，因此SPE的吸附劑一直是人們關(guān)注的熱點。自SPE發(fā)明以來，聚合樹脂的樣品污染一直令人苦惱，1978年Waters公司發(fā)明了C18鍵合硅膠制成一次性小柱(Sep-pakR)，具有很高的可靠性和穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于臨床生化檢驗。凡可用于HPLC的吸附劑均可用于SPE，包括近年來針對藥物濫用檢測的“designerphase”。吸附劑的選擇既要考慮樣品各組分與固定相的親和力、待測物與洗脫劑的作用力，還要考慮其通用性。就目前化學鍵合相而言，非極性鍵合相有C1、C2、C4、C6、C8、環(huán)己烷基、苯基、二苯基、C18等；極性和弱離子交換相有：氰基、二醇基、氨基、伯胺/仲胺基、丁酸基；強離子交換相有：丙磺酸基、苯磺酸基、季銨基等；吸附樹脂有：XAD-2、GDX、X-5。具有選擇專屬性的苯基磺酸可用于分離共平面連位羥基結(jié)構(gòu)分子。對于生物樣品，大多溶解在水性物質(zhì)里，待測物被離子化，用離子交換萃取分離極性很強的物質(zhì)，非極性或弱極性分析物用R-P提取，正相萃取用于提取有機溶劑中的極性物質(zhì)。吸附劑的用量必須保證從樣品中有效吸附所有的待測物，不保留基質(zhì)成分，增加吸附劑的量可增大吸附能力，但同時也增大洗脫體積，使待測物稀釋，給干燥和定量帶來困難。因此在達到有效吸附的前提下用最小量的吸附劑。