[科普中國]-肉與肉制品：維生素E含量測定

原理

試樣經(jīng)皂化后，用石油醚提取不皂化的維生素E，濃縮后，用高效液相色譜儀測定，用外標(biāo)法計算樣品中維生素E的含量。

試劑除特別標(biāo)明外，所用試劑均為分析純。

（1）水：符合GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水。

（2）無水乙醇。

（3）石油醚：沸程30～60℃。

（4）無水硫酸鈉。

（5）異丙醇。

（6）甲醇：色譜純或重蒸后使用。

（7）氫氧化鉀溶液（500g/L）:稱取50g氫氧化鉀，溶于水中，用水稀釋至100mL。

（8）抗壞血酸溶液（100g/L）:稱取10g抗壞血酸（維生素C），溶于水中，用水稀釋至100mL。

（9）α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：DL-α-生育酚或DL-α-生育酚醋酸酯。

（10）α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)溶液

①標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000ug/mL）

若標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為α-生育酚，則稱取50.0mg，用異丙醇溶解，定容于50mL棕色容量瓶中。4℃保存。

臨用前用紫外分光光度計按“標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定”標(biāo)定其濃度。

若標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為α-生育酚的酯類物質(zhì)，則稱取50.0mg，按“分析步驟”進行皂化、提取、濃縮，用異丙醇溶解，定容于50mL棕色容量瓶中。4℃保存。

②標(biāo)準(zhǔn)工作液

用異丙醇將已標(biāo)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

臨用前配制。

③標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定

移取α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液100uL于5mL具塞試管中，用無水乙醇稀釋至3mL，于波長294nm處用紫外分光光度計測定α-生育酚的吸光度值。

按下式計算α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液的濃度：

式中：

c1：α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液的濃度，g/mL;

A：α-生育酚的紫外吸收值；

Ecm：α-生育酚的1%比吸光系數(shù)，即溶液濃度為1%、光路為1cm時的吸收系數(shù)，值為71；

V1：移取α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液的體積，uL。

儀器和設(shè)備實驗室常規(guī)儀器及下列儀器。

（1）機械設(shè)備：用于試樣的均質(zhì)化，包括高速旋轉(zhuǎn)的切割機，或多孔板的孔徑不超過4mm的絞肉機。

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

（3）液相色譜儀：帶紫外或熒光檢測器。

（4）紫外分光光度計。

取樣實驗室所收到的樣品應(yīng)具有代表性且在運輸和儲藏過程中無受損或發(fā)生變化。

取樣方法參見GB∕T 9695.19。

取有代表性的樣品200 g。

試樣制備使用適當(dāng)?shù)臋C械設(shè)備將試樣均質(zhì)。注意避免試樣的溫度超過25℃。若使用絞肉機，試樣至少通過該設(shè)備兩次。

將試樣裝入密封的容器里，防止變質(zhì)和成分變化。試樣應(yīng)在均質(zhì)化后24 h內(nèi)盡快分析。

分析步驟注：維生素E易被氧化,實驗應(yīng)避光或充氮操作,并使用棕色玻璃儀器。

皂化稱取0.5～5g（準(zhǔn)確至0.001g）試樣于150mL燒瓶中，加入抗壞血酸溶液3mL，氫氧化鉀溶液5mL，無水乙醇30mL，混勻，于沸水浴上回流15～30min，使試樣溶液清澈，皂化后于流水中冷卻。

提取將皂化后的試樣溶液移入125mL分液漏斗中，用30mL石油醚分?jǐn)?shù)次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，塞上塞子，輕搖分液漏斗，避免乳化。靜置，待分層后，將水層放入第二個分液漏斗中，醚層留在第一個分液漏斗中，于第二個分液漏斗中倒入10mL石油醚，進行第二次提取，如此進行3～4次，石油醚層并入第一個分液漏斗中。

石油醚層反復(fù)用水洗滌，直至水層呈中性(pH約為7)，棄去水層。將分液漏斗中石油醚層經(jīng)過無水硫酸鈉脫水后，放入棕色圓底燒瓶中，用少量石油醚洗滌無水硫酸鈉和分液漏斗，洗液并入棕色圓底燒瓶中。

分析試樣溶液的制備將盛有石油醚提取液的圓底燒瓶與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器連接，于40～60℃水浴上減壓蒸餾石油醚，待瓶內(nèi)只剩約1～2mL液體時，取下燒瓶，用氮氣吹干剩余液體，立即加入2.0mL異丙醇，塞上塞子,以防溶劑揮發(fā)。此為色譜分析用樣液。

測定液相色譜參考條件

色譜柱：C18柱（150mm×4.6mm，5μm），或相當(dāng)者；

流動相：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

檢驗器：紫外檢測器：波長292nm；熒光檢測器，激發(fā)波長為298nm，發(fā)射波長為325nm；

進擇量：20μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將α-生育酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進行高效液相色譜分析，記錄峰面積或峰高，以α-生育酚的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰高或峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注：α-生育酚應(yīng)能與β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚分離

試樣溶液的測定

將制備好的試樣溶液按標(biāo)準(zhǔn)工作液的液相色譜條件進行測定。根據(jù)試樣溶液的峰面積或峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)α-生育酚的濃度。

平行試驗按“分析步驟”，對同一試樣進行平行試驗測定。

空白實驗除不加入試樣外，均按“分析步驟”進行測定。

計算式中:

X：試樣中α-生育酚的含量，mg/100g；

c2：根據(jù)試樣的峰面積或峰高查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的α-生育酚的濃度，μg/mL；

V2：試樣液最終定容的體積，mL；

m：試樣質(zhì)量，g。

計算結(jié)果應(yīng)扣除空白，結(jié)果準(zhǔn)確至0.01mg/100g。

精密度同一分析者在同一實驗室采用相同的方法和相同的儀器，在短時間間隔內(nèi)對同一樣品獨立測定兩次，兩次測試結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的30%。1