[科普中國]-蘋果酸-乳酸發(fā)酵

定義

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下將L-蘋果酸脫羧基形成 L-乳酸的過程，是葡萄酒生產(chǎn)難以控制的二次發(fā)酵過程，主要由酒類酒球菌引起。

在葡萄酒的釀造過程中，蘋果酸-乳酸發(fā)酵不僅可降低生葡萄酒的酸澀和粗糙感，使之柔和、圓潤，而且還提高了葡萄酒的感官質(zhì)量和生物穩(wěn)定性，所以，許多優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒都要進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵。北方地區(qū)氣候寒冷，蘋果酸度較高，釀造出的蘋果酒口感較酸澀，需要進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵來改善其風(fēng)味。相反，南方地區(qū)蘋果酸度較低，有些釀酒師并不提倡進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵，所以目前更多的釀酒師考慮的是蘋果酸乳酸發(fā)酵對葡萄酒、蘋果酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)。1

MLF所需微生物乳酸菌LAB在自然界廣泛存在，可存在于葡萄的果實和葉梗的表面。LAB為原核微生物，革蘭氏染色陽性細(xì)菌，其生長繁殖需要從生物氧化中獲得能量，當(dāng)某化合物氧化時便失去電子，為平衡代謝某化合物接受電子而被還原。在蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化中，蘋果酸是電子供體，而乳酸是電子的受體。LAB也能用丙酮酸作為電子受體，并產(chǎn)生乳酸。2

MLF對葡萄酒品質(zhì)的影響降酸作用MLF將氫離子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03 g酒石酸酸度/L，pH增加0.3，這一點非常重要，因為如果葡萄酒pH低于3.5，LAB的代謝活性可以升高pH水平，從而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。

提高細(xì)菌穩(wěn)定性MLF可以提高葡萄酒中細(xì)菌的穩(wěn)定性，MLF發(fā)生時由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗或細(xì)菌素的產(chǎn)生其他微生物的生長受到抑制。MLF發(fā)生的時間也很重要，如果發(fā)生在葡萄酒裝瓶之前，就可預(yù)防其在瓶中的生長。LAB在瓶中的生長或可引起葡萄酒渾濁、CO2產(chǎn)生，產(chǎn)生多糖導(dǎo)致酒體變黏，或pH提高促使其他腐敗微生物的生長等。

風(fēng)味的改善葡萄酒經(jīng)LAB發(fā)酵之后，不僅產(chǎn)生乳酸，也產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，對葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響。 在有限通風(fēng)條件下，酒類酒球菌傾向于產(chǎn)生乳酸和乙醇，欲產(chǎn)生更多乳酸則要求更多的通風(fēng)。然而，其他LAB在此條件下可能產(chǎn)生醋酸，醋酸本身有刺激性，所產(chǎn)生的醋酸的量非常重要，應(yīng)避免超出感官檢測的閾值。LAB產(chǎn)生的另一個重要的化合物是雙乙酰，雙乙酰有特征性的奶油風(fēng)味。雙乙酰的形成取決于前體物質(zhì)的出現(xiàn)，可由乙醛和乙酰CoA反應(yīng)形成，或丙酮酸和乙醛反應(yīng)產(chǎn)生五碳的乙酰乳酸，后者進(jìn)而再形成四碳的雙乙酰分子和一分子CO2。LAB 發(fā)酵過程中可產(chǎn)生的 2，3-丁二醇來自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的風(fēng)味，通常在檢測閾值以下。它的形成是一個還原的過程，即電子以乙偶茵和 2，3-丁二醇的形式固定。LAB 發(fā)酵過程中還產(chǎn)生乳酸乙酯、丙烯醛等，對葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響。在含氮豐富的果汁發(fā)酵時，葡萄酒中出現(xiàn)奶酪的風(fēng)味。賴氨酸是酵母的重要營養(yǎng)，但過量添加會導(dǎo)致出現(xiàn)所謂的鼠臭味。一些植物乳桿菌和短乳桿菌代謝酒石酸為醋酸，產(chǎn)生所謂的敗壞病，這些是葡萄酒釀造中不希望看到的。2

影響因素pH影響MLF的最主要的因素是pH，其影響除提供質(zhì)子梯度外，它決定哪些種類的LAB會出現(xiàn)，影響生長的速率，當(dāng)pH低至一定程度時就變?yōu)槲⑸锏囊种苿?。pH也影響微生物的代謝，在pH3.2以下時許多LAB分解蘋果酸，在pH3.5時則進(jìn)行糖的分解。在pH3.8時MLF的速率高于pH3.8以下時的速率，在pH3.2時比在pH3.8時慢10倍。有的菌株對pH有高的耐受性。在 pH3.5以下的葡萄酒中，酒類酒球菌是優(yōu)勢菌群，在較高的pH條件下乳桿菌和片球菌可以生 存和生長。

SO2LAB對SO2非常敏感，比酵母敏感的多。所有LAB具有相同的敏感性，酒球菌中沒有耐受性菌株。SO2分子或其游離形式是其抑制劑形式。游離SO2的出現(xiàn)取決于pH，結(jié)合的SO2也對 LAB有抑制作用，但作用較小。酵母產(chǎn)生一定量的SO2，產(chǎn)生的亞硫酸鹽量在20 mg/L以上，如果pH條件合適足以抑制LAB的生長。酒類酒球菌對亞硫酸鹽的耐受性達(dá)30 mg/L，對低pH 耐受的菌比不耐受的菌生存的更好。在酸性培養(yǎng)基（pH3.5）中的適應(yīng)性階段加入亞致死濃度的亞硫酸鹽(15 mg/L)，增加LAB對亞硫酸鹽的適應(yīng)性。3

乙醇LAB對乙醇的耐受性有一定的限制。一般情況下乙醇濃度為14%時LAB被抑制，但有的比較敏感。如果用晚收的葡萄或高白利糖度果汁進(jìn)行MLF，需要在乙醇發(fā)酵前進(jìn)行。一般而言，乙醇濃度越高M(jìn)LF越慢。乙醇對LAB的蘋果酸乳酸代謝有強(qiáng)烈的干擾作用，高的乙醇濃度降低LAB的最低生長溫度，升高溫度則降低乙醇耐受性。盡管在葡萄酒中的乙醇濃度（8 %-12 %，體積分?jǐn)?shù))不抑制MLF，但酒類酒球菌的生長速率隨乙醇濃度的增加呈線性降低，14 %是大部分菌株乙醇耐受性的上限。酒類酒球菌乙醇耐受性的建立是復(fù)雜的，取決于休克的程度和期限，也取決于培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分、pH、和溫度。

溫度溫度對MLF極其重要，LAB生長的最佳溫度為20℃-37℃，15℃以下時生長受到抑制。在允許的范圍內(nèi)，溫度越高生長越快，乳酸產(chǎn)生越高。溫度影響LAB生長速率和遲滯期的長短，因此也影響LAB的數(shù)量。酒類酒球菌的最佳生長速率約在25℃。然而，預(yù)先在42℃培養(yǎng)處理，促進(jìn)其在葡萄酒中的存活和進(jìn)行MLF的能力，后一溫度誘導(dǎo)其合成應(yīng)激蛋白，許多應(yīng)激蛋白作為分子伴侶或蛋白酶參與蛋白質(zhì)的重新折疊或變性細(xì)胞蛋白的分解。在不同的生長條下，為了維持膜的最佳流體性，細(xì)胞調(diào)節(jié)其細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分。生長溫度增加誘導(dǎo)飽和脂肪酸比例的增加，而不飽和脂肪酸減少。

氧和二氧化碳分子氧對MLF的作用取決于微生物的種類，其刺激一些LAB的生長機(jī)理和酵母相似。葡萄酒生產(chǎn)時，有限的氧化作用似乎刺激MLF，然而，如果氧含量太高，并且如果有專性異型發(fā)酵微生物，可能導(dǎo)致產(chǎn)生醋酸。因此，在MLF中應(yīng)限制進(jìn)行通風(fēng)操作以避免不期望的終產(chǎn)物的出現(xiàn)。LAB具有發(fā)酵代謝途徑，在有氧的條件下通常生長不好。然而，一些明串珠菌菌株有氧培養(yǎng)時由于誘導(dǎo)性NAD（P）H-氧化酶的出現(xiàn)，生長良好。這些酶使得細(xì)胞從乙酰磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿岖@得ATP。其他LAB，如植物乳桿菌和乳酸乳桿菌從氧氣不能獲得益處，但 氧氣的出現(xiàn)也不抑制它們。嚴(yán)格的厭氧條件促進(jìn)酒類酒球菌的生長，在充氣條件下以葡萄糖作為惟一碳源不生長。氧使乙醇形成過程中的酶，乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶失活，因此，阻止異型乳酸發(fā)酵糖分解第一階段中產(chǎn)生的輔酶的再氧化。而且，酒類酒球菌在有氧條件下缺乏重要的NAD（P）H-氧化酶活性，這些結(jié)果表明，對葡萄糖的有氧代謝輔酶的產(chǎn)生是限制性因子。 加入果糖或丙酮酸，作為電子受體，輕微促進(jìn)酒類酒球菌的生長。果糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?，氧化兩分子的NAD（P）H，丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，使NAD+再生。CO2刺激LAB的生長，但其機(jī)理不清。4