[科普中國]-葡萄籽提取物

特性抗氧化能力

葡萄籽提取物是純天然物質(zhì)，是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源最高效的抗氧化劑之一，試驗表明，其抗氧化效果是維生素C和維生素E的30～50倍。1

活性原花青素具有極強的活性，能抑制香煙中的致癌物，在水相中對自由基的捕捉能力是一般抗氧化劑的2～7倍，如比α-生育酚的活性高兩倍以上。1

葡萄籽原花青素的提取研究發(fā)現(xiàn)，在眾多的植物組織中, 葡萄籽與松樹皮提取物中原花青素的含量最高2, 而從葡萄籽中提取原花青素的方法主要有溶劑提取法、微波浸提法 、超聲提取法和超臨界CO2 萃取法3等。葡萄籽原花青素提取物中含有很多雜質(zhì), 需進一步純化才能提高原花青素的純度, 常用的純化方法有溶劑萃取、膜過濾及色譜法。

乙醇濃度對葡萄籽原花青素提取率的影響最為顯著, 提取時間和溫度對葡萄籽原花青素提取率的影響都不顯著。其最佳提取工藝參數(shù)為: 乙醇濃度70% , 提取時間120m in, 料液比1:??20。4

靜態(tài)吸附實驗表明HPD- 700 對原花青素的吸附率最高為82.??85%, 其次為DA201, 為82.??68%, 其差值相差不大, 而且, 這兩種樹脂對原花青素的吸附量也相同; 在解吸試驗中,DA201 樹脂對原花青素的解吸率最高, 為60.??58%, 而HPD- 700對原花青素的解吸率只有50.??83%。結(jié)合吸附試驗和解吸實驗, 確定DA210樹脂為分離原花青素的最佳吸附樹脂。4

通過工藝優(yōu)化, 在原花青素濃度為0??15mg /mL時, 流速為1mL /m in, 以70% 的乙醇溶液作為洗脫劑, 流速為1mL /m in, 洗脫劑用量為5BV,可以對葡萄籽原花青素的提取液進行初步純化。4

有效成分的測定Bate- Smith 法此法測定的是葡萄籽提取物中的原花青素, 其含量用原花青素指數(shù)( procyanidolic index ) 來表示。由于目前沒有原花青素的標(biāo)準(zhǔn)品, 因此此方法測定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相對值。5

原理

原花青素在酸性條件下加熱轉(zhuǎn)化為紅色的花青素。

操作程序

稱取適量的葡萄籽提取物( 約15~ 40mg) 用甲醇溶解, 最后定溶于100ml。從中取1ml 樣品溶液加到10ml 比色管中, 然后再加入6ml 鹽酸- 正丁醇溶液( 5/ 95, V/V) , 在97℃± 1 下反應(yīng)40min 后,取出迅速冷卻, 在550nm 處測定其吸光度, 以甲醇代替提取物溶液作為空白。5

原花青素指數(shù)= A ×7. 0/W

A: 吸光度; W: 樣品質(zhì)量( g)

由于用Bate- Smith 法測得的葡萄籽提取物中原花青素指數(shù)一般在80~ 100 之間, 有時也可能大于100。

Porter 法由于Bate- Smith 法測定的結(jié)果重現(xiàn)性很差,并且原花青素在此條件下反應(yīng)不是很徹底。因此Porter 等人對Bate- Smith 法進行了改進。Porter 法改進之處主要是在試劑中添加了Fe3+ , 以提高反應(yīng)的程度和顏色的穩(wěn)定性。此方法測定的也是原花青素的相對含量, 結(jié)果用PVU( porter value unit )表示。porter 法的原理同Bate- Smith 法5

操作程序

稱取適量的葡萄籽提取物( 約10~ 30mg) 用甲醇溶解, 最后定溶于100ml。從中取1ml 樣品溶液加到10ml 比色管中, 然后依次加入6ml 鹽酸- 正丁醇( 5/ 95, V/ V) , 0. 2ml 2. 0% 硫酸鐵銨溶液( 用2mol.L- 1 的鹽酸溶解) , 在97℃± 1下反應(yīng)40min后, 取出迅速冷卻, 在550nm 處測定其吸光度, 以甲醇代替提取物溶液作為空白。5

PVU= A × 7. 2/W

A: 吸光度; W: 樣品質(zhì)量( g)

美國葡萄籽方法評定委員會認(rèn)為葡萄籽提取物的PVU 在250~ 350 之間是比較理想的。PVU 過低, 可能說明該產(chǎn)品中原花青素的含量較低, PVU過高, 說明該產(chǎn)品中高聚體原花青素含量較高。但由于porter 法不能區(qū)分測出的是何種原花青素, 所以若一種葡萄籽提取物測出的PVU 為300, 則該產(chǎn)品可能是低聚體原花青素含量較多, 也可能是單體和高聚體原花青素含量較多。

美國葡萄籽方法評定委員會認(rèn)為上述兩種方法不能作為葡萄籽提取物中總多酚或原花青素的定量分析方法。

?? Folin- Ciocalteau此法測定的是葡萄籽提取物中總多酚的含量, 一般以沒食子酸作為對照品。此方法的優(yōu)點是能定量分析提取物中總多酚的含量。缺點是: 不能區(qū)分多酚的種類( 例如測定的是單體, 還是聚合體) ; 另外蛋白質(zhì), 核酸, 抗壞血酸等易被氧化的物質(zhì)也參與此反應(yīng); 不能辨別葡萄籽提取物是否攙假; 由于單體和原花青素反應(yīng)的系數(shù)( factors) 不一樣, 所以測定的含量和葡萄籽提取物中的真實含量有一定偏差。5

?? 原理

在堿性溶液中, 酚類化合物可以將鎢鉬酸還原(W6+ 變?yōu)閃5+ ) , 生成藍色的化合物, 顏色的深淺與多酚含量呈正相關(guān), 藍色化合物在760nm 處有最大吸收。

操作程序

稱取適量的葡萄籽提取物, 用水溶解, 濃度在0. 1mg/ ml 左右。取1ml 樣品液加到10ml 比色管中, 然后依次加入1ml 去離子水, 0. 5ml Folin- Cio??calteau 試劑, 1. 5ml 26. 7%Na2CO3 溶液, 最后用水定容至10ml, 室溫下反應(yīng)2 小時, 在760nm 下測定其吸光度。

以沒食子酸作為對照品, 配制不同濃度的溶液, 按上述方法反應(yīng), 測得吸光度。以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得提取物中總多酚的含量( 以相當(dāng)于沒食子酸的含量表示( gallicacid equivalent) ) 。5

美國葡萄籽方法評定委員會同意采用此種方法來測定葡萄籽提取物中的總多酚, 但同時建議此方法還需進一步完善, 以確認(rèn)單體和原花青素同F(xiàn)olin- Ciocalteau 試劑反應(yīng)的差異。

?? 香蘭素檢測法(Vanillin assay?? 此法測定的是葡萄籽提取物中黃烷- 3- 醇的含量, 但不能區(qū)分其中的單體和聚合體。一般用兒茶素作標(biāo)準(zhǔn)品去定量測定。

?? 原理

在酸性條件下, 間苯三酚、間苯二酚A 環(huán)的黃烷醇和聚原花青素A 環(huán)的化學(xué)活性較高, 其上的間苯三酚或間苯二酚可與香蘭素發(fā)生縮合, 產(chǎn)物在酸作用下形成有色的正碳離子, 樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān)。5

操作程序

稱取適量的葡萄籽提取物用一定體積的甲醇溶解, 最后葡萄籽提取物溶液的濃度為0. 1mg/ ml左右。取樣品溶液1ml 加到10ml 比色管中, 然后依次加入2. 5ml 香蘭素甲醇溶液( 1. 0% W/V) ,2. 5ml 25% 硫酸甲醇溶液。室溫下反應(yīng)15min, 在510nm 測定其吸光度。

以兒茶素作為對照品, 配制不同濃度的溶液,按上述方法反應(yīng), 測得吸光度, 以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得提取物中黃烷- 3- 醇的含量。

香蘭素檢測法測定葡萄籽提取物中黃烷- 3-醇一般是用甲醇溶解提取物, 配制試劑。另外也可用冰醋酸溶解提取物, 配制試劑。但二者測定的數(shù)據(jù)有很大差異。用甲醇作溶劑時, 香蘭素法測定的是總黃烷- 3- 醇的量, 對于聚合原花青素中所有的黃烷- 3- 醇的量都能發(fā)生此反應(yīng)。而用冰醋酸用溶劑時, 香蘭素法測定的是單體黃烷- 3- 醇和聚合原花青素末端黃烷- 3- 醇的量, 而聚合原花青素中間的黃烷- 3- 醇不能被測出。而目前大多用甲醇作溶劑來測定葡萄籽提取物中黃烷- 3- 醇的量。同時采用兩種溶劑可大概測出提取物中原花青素的平均聚合度。5

美國葡萄籽方法評定委員會已經(jīng)同意不采用此方法來檢測葡萄籽提取物中的有效成分。

HPLC 法此法測定的是提取物中每種單體, 低聚體, 高聚體的含量。但由于對照品的限制以及分析手段的制約, 目前只能測定葡萄籽提取物中單體和某些低聚體的含量。實際應(yīng)用中只需測定其中的單體含量即可。葡萄籽提取物中主要的單體為: 兒茶素, 表兒茶素, 沒食子酸, 表兒茶素沒食子酸酯。5

葡萄籽提取物中單體的含量一般在10. 0% 左右, 最高可達到30. 0% 。由于葡萄籽提取物成分的復(fù)雜性, 若樣品未經(jīng)預(yù)處理,HPLC 法一般很難把多種單體完全分離開來。所以進樣前, 需對提取物進行預(yù)處理, 以去除其中的高聚體, 提高單體的含量。常用的預(yù)處理方法有: 硅膠柱層析, SephadexLH- 20, Sephadex G25,Toyopeah TSK HW40. 等柱層析方法[ 8] 。也可采用薄層層析法對樣品進行預(yù)處理, 一般用甲苯: 丙酮: 乙酸= 3: 3: 1( v/ v/ v) 作展開劑。5