[科普中國]-菌種保藏

目的

微生物在使用和傳代過程中容易發(fā)生污染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退，并有可能使優(yōu)良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，保持菌株優(yōu)良性狀不退化，保持優(yōu)良菌株存活，以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。2

原理菌種保藏有多種方法，其原理大多大同小異，主要是運用一些方式盡量降低生物體內的代謝，達到延長生命，減少變異的目的。通常采用的方法為低溫、缺氧、干燥。

低溫主要對菌種產(chǎn)生兩方面的影響，首先，較低的溫度可以減緩機體細胞的酶活，降低新陳代謝，達到保藏菌種的目的。其次，低溫同時會導致菌體誘發(fā)菌絲自溶機制，如果降溫過程失誤，同樣會造成機體的機械損傷和溶質損傷。

微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設計的。3

實驗器材
細菌、酵母菌，放線菌和霉菌。
肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95%酒精，10%鹽酸，無水氯化鈣。
滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0.5×1.2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。

具體方法傳代培養(yǎng)保藏法包括又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等，培養(yǎng)后于4-6℃冰箱內保存。

其中斜面培養(yǎng)法是將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。

此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養(yǎng)基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機會亦較多。

液體石蠟覆蓋保藏法
液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。

本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止狀態(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4-4℃下，液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。

具體的操作方法：

1、將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm，121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。

2、將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。

3、用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。
4、將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。
此法實用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優(yōu)點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經(jīng)常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。

載體保藏法載體保藏法是將微生物吸附在適當?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

（一）沙土保藏法

1、取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機質。

2、倒去酸水，用自來水沖洗至中性。

3、烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

4、另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。

5、烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

（二）濾紙保藏法

1、將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃滅菌30分鐘。

2、將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。

3、取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內混勻，制成濃懸液。

4、用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

5、將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。

6、將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下。

7、需要使用菌種，復活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內，置溫箱中培養(yǎng)。

細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設備。

寄主保藏法
寄主保藏法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。

冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常見的是甘油管冷凍保藏法。

甘油管冷凍保藏法是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時間較短。或采用體積比為8：2的甘油-生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。

該方法適用于一般細菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油-生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

冷凍干燥保藏法
先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥），其中真空冷凍干燥法最常見。

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。真空冷凍干燥法是在低溫下快速將細胞凍結，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要采用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。4

注意事項無論采用何種保藏方法，首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應根據(jù)微生物生理、生化特點，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。

影響因素菌的質量保藏的菌種應培養(yǎng)在營養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對環(huán)境抵抗力強。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細胞濃度要高不同的菌對冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細胞濃度不高，就會使以后傳種造成困難，保存期也會受到影響。

保護劑不同種類的保護劑對不同微生物的作用是不同的，如個別菌種在脫脂乳作保護劑的情況下死亡率高達99.99%，而采用葡聚糖等混和保護劑時死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對保護劑的要求不很嚴格，而不易保存的菌種對保護劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護劑是冷凍干燥保存菌種的關鍵因素。

干燥速度實驗表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。

空氣的影響冷凍干燥后空氣對細菌細胞影響較大，可導致細胞損傷進而死亡，故在凍干后應立即在真空下融封，才有利于長期保存。

溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠沒有上述幾項因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。

含水量的影響水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細胞含水量控制在3%以下(1%-3%)。5

機構菌種保藏可按微生物各分支學科的專業(yè)性質分為普通﹑工業(yè)﹑農業(yè)﹑醫(yī)學﹑獸醫(yī)﹑抗生素等保藏管理中心。此外﹐也可按微生物類群進行分工﹐如沙門氏菌﹑弧菌﹑根瘤菌﹑乳酸桿菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藻類等保藏中心。

目前﹐世界上約有 550個菌種保藏機構。其中著名的有美國典型菌種保藏中心(簡稱ATCC﹐馬里蘭)﹕1925年建立﹐是世界上最大的﹑保存微生物種類和數(shù)量最多的機構﹐保存病毒﹑衣原體﹑細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑真菌﹑藻類﹑原生動物等約 29000株﹐都是典型株﹔荷蘭真菌菌種保藏中心(簡稱CBS﹐得福特):1904年建立﹐保存酵母菌﹑絲狀真菌約 8400種﹑18000株﹐大多是模式株﹔英國全國菌種保藏中心(簡稱NCTC﹐倫敦)﹕保存醫(yī)用和獸醫(yī)用病原微生物約2740株﹔英聯(lián)邦真菌研究所(簡稱CMI﹐薩里郡)﹕保存真菌模式株﹑生理生化和有機合成等菌種2763種﹐8000株﹔日本大阪發(fā)酵研究所(簡稱IFO﹐大阪):保存普通和工業(yè)微生物菌種約9000株﹔美國農業(yè)部北方利用研究開發(fā)部(北方地區(qū)研究室﹐簡稱NRRL﹐伊利諾伊州皮契里亞)﹕收藏農業(yè)﹑工業(yè)﹑微生物分類學所涉及的菌種﹐包括細菌5000株﹐絲狀真菌1700株﹑酵母菌6000株。

1970年 8月在墨西哥城舉行的第10屆國際微生物學代表大會上成立了世界菌種保藏聯(lián)合會(簡稱WFCC)﹐同時確定澳大利亞昆士蘭大學微生物系為世界資料中心。這個中心用電子計算機儲存全世界各菌種保藏機構的有關情報和資料﹐1972年出版《世界菌種保藏名錄》。

中國于1979年成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(簡稱CCCCM﹐北京)。6