[科普中國]-DNA shuffling

技術(shù)的建立

大多數(shù)生物體進化都來自于自然選擇和性繁殖,其中在真核生物性重組便是生物進化的一種主要方式。早在1990年, Marton和Meyerhans等人就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外PCR中存在的DNA重組現(xiàn)象,并指出該重組現(xiàn)象是由DN A斷裂或出現(xiàn)切口引起的。1994年美國的Stemmer 等以LacZα基因為實驗材料,用DNase I進行消化,得到10～ 70 bp大小的隨機片段集合, 在不加入引物的情況下, 利用PCR得到了全長的LacZα產(chǎn)物,從而以巧妙的設(shè)計驗證了體外PCR中存在的DNA重組現(xiàn)象。Stemmer 將該技術(shù)稱為體外DN A shuffling 技術(shù),并于1998年申請了專利。由于該方法一定程度上模擬了生物體自然進化過程中減數(shù)分裂期等位基因間的DNA片段互換(有性交換, sexual exchange) ,故DNA shuffling 又被稱為有性PCR(sexual PCR)1。

技術(shù)的原理DNA shuffling 技術(shù)是一種利用多次、反復(fù)選擇和重組以獲得具有預(yù)期性狀的多聚核苷酸的方法。其原理大致如下: 先將由多種同源核苷酸序列組成的模板(初級文庫)進行隨機片斷化,所產(chǎn)生的隨機片段集合包含了至少1000種以上寡核苷酸,這些寡核苷酸來自不同的同源序列,具有不同的3′末端,這一點是下一步隨機重排的前提條件。利用PCR技術(shù)在不加入引物的情況下對這些隨機化片段進行重新排布: 在起初的幾輪循環(huán)中, 具有互補3′末端的來自不同模板序列的寡核苷酸互為引物,擴增出一段較長的核苷酸產(chǎn)物; 接著下一輪循環(huán)時,以上輪產(chǎn)物為模板,又將產(chǎn)生一段更長的核苷酸產(chǎn)物,隨著擴增數(shù)遞增,模板的不斷變化,產(chǎn)物長度亦在不斷遞增,如此,經(jīng)過多輪擴增,最終將獲得多種低拷貝的全長的重排產(chǎn)物,這些集合的重排產(chǎn)物又被稱為嵌合文庫(突變文庫)。對嵌合文庫進行篩選,選擇改良的突變體組成下一輪shuffling 的模板(次級文庫) ,重復(fù)上述步驟進行多次重排和篩選,直到最終獲得性狀比較理想的突變體。

利用隨機化片段的重新排列組合產(chǎn)生多樣化的突變文庫是DNA shuf fling 技術(shù)的精髓所在,這一點有點類似assembly PCR。其優(yōu)點是: 可以在體外實現(xiàn)同源序列間的重組,并可能實現(xiàn)那些對進化有利的點突變的優(yōu)化組合,最終獲得性狀改良比較理想的突變體1。

具體方法目的性狀的確立和模板的來源目的蛋白的改造必須針對一定的表型特征,即要針對特定的目的性狀,包括結(jié)構(gòu)和功能方面的特性。如熒光蛋白的熒光強度、最大波長及酶的催化能力、熱穩(wěn)定性、底物的專一性等。此外,一些DNA調(diào)控序列,如啟動子、5′UTR、3′UTR等也可以作為靶序列進行改造以改善其調(diào)控功能。模板可以由多個同源序列或同源基因(如家族基因)組成初級文庫( primary libiary ) ,也可以單個基因組成。后者在DNA shuffling 之前要先利用其它突變方法對單個基因進行突變, 或在DNA shuffling 的同時借助聚合酶產(chǎn)生的點突變以產(chǎn)生多樣性的突變產(chǎn)物。同源靶序列的長度在50 bp～ 50 kb之間,一般通過PCR獲得,反應(yīng)后應(yīng)除去多余的引物, 以提高重組效率。

隨機片斷化處理初級文庫(模板)用DNase I或多種內(nèi)切酶處理后,獲得隨機片段集合。隨機片段大小應(yīng)在20～ 500bp之間為宜。并對片段集合進行純化,除去未消化的模板,以避免原序列的污染。

無引物的PCR擴增在不加引物的情況下,將以上片段集合置于適當?shù)腜CR系統(tǒng)中進行PCR擴增。該步要求片段集合有較高的總量和濃度,同時還要求PCR反應(yīng)有較高的循環(huán)數(shù),以保證產(chǎn)生多樣性足夠好的嵌合文庫(突變文庫)。

加入引物的PCR擴增上一步的PCR產(chǎn)物按一定比例稀釋,同時加入兩外側(cè)引物, 選用較少的循環(huán)數(shù), 如15輪, 進行PCR擴增,便可獲得大量的全長目的基因,即放大的嵌合文庫(突變文庫)。有時PCR產(chǎn)物中還可能存在全長目的基因的線形多拷貝聚合體,如Stemmer等對全長2. 7 kb的pUC19質(zhì)粒進行DN A shuffling 時,得到的產(chǎn)物大多在20 kb以上,但用適當?shù)膬?nèi)切酶消化后,即得到均一的全長目的基因。

克隆、篩選、分析及多輪篩選PCR產(chǎn)物用適當?shù)膬?nèi)切酶處理,克隆到表達載體中并轉(zhuǎn)入宿主細胞(如大腸桿菌,噬菌體等)中進行表達,在特定的選擇壓力下,選擇目的性狀改良的突變體; 將選擇到的突變體混合在一起,作為下一次DNA shuffling 的模板(次級文庫) ,選擇壓力不斷提高,重復(fù)1～ 5步驟進行多次選擇和重組,直到最終得到性狀改良明顯的理想的突變體為止。在進行DNA shuf fling 時,最重要的是選擇合適的篩選模型,只有選擇的模型恰當,才會減少工作量,快速地實現(xiàn)預(yù)期目標。如欲提高酶的熱穩(wěn)定性,應(yīng)以不斷遞增的溫度為選擇壓力,通過突變產(chǎn)物(酶)對底物的活性變化來篩選熱穩(wěn)定性改良的酶;如果改造對象是細菌的酶,還可以選擇該酶缺陷的細菌為宿主細胞進行篩選。

改進自Stemmer提出DNA shuffling 以來, 這種體外DNA 重組的方式引起了各國學(xué)者濃厚的興趣, 包括Stemmer本人在內(nèi)的許多學(xué)者提出各種改進方法, 使DNA shuffling 技術(shù)更加多樣化, 在不同需求的引導(dǎo)下發(fā)展出了一些各具特色的新方法2。

DNA-family -shufflingDNA-family -shuffling 技術(shù)是根據(jù)自然界中存在許多物種來源不同、基因序列有所差異但功能相似的基因家族建立的, 用于改組的基因家族中的一組基因, 可以是來源于同一物種的某一基因家族, 也可以是來源于不同物種、屬間有一定程度同源性的基因, 該技術(shù)在體外模擬達爾文進化的過程, 大大提高了基因體外定向進化的速度和效率。

DNA-family -shuffling 技術(shù)與單基因shuffling 相比, 具有兩個明顯的優(yōu)勢:首先, 改良效率高。Crameri A 等[2] 在實驗中選用了4 種同源性為58 ～ 82%的來自不同菌屬的頭孢菌素C酶基因作為親本, 改組后使酶活性增加了270 ～ 540 倍, 而單基因shuffling 只增加了8 倍。其次, 提高了突變機率。由于基因家族改組的塊交換特性(block -exchange nature), 使得突變的幾率大大提高了, 前例中β 內(nèi)酰胺酶基因在3 次單基因改組循環(huán)后, 只得到了一株4 個突變氨基酸的突變株, 而四個頭孢菌素C 酶基因在一次DNA-family -shuffling 后就產(chǎn)生了102 ～196 個突變氨基酸的突變株。

StEPStEP(Staggered extension process, 交錯延伸程序)是指在一個反應(yīng)體系中以兩個以上相關(guān)的DNA 片段為模板, 進行類似PCR 反應(yīng), 合成在目的基因兩側(cè)的引物, 引物先在一個模板鏈上延伸, 隨之進行多輪變性和短暫的復(fù)性-延伸循環(huán)。每次循環(huán)被延伸的片段在復(fù)性時與不同的模板配對, 并延伸一段非常短的距離。由于模板的改變, 所合成的DNA 片段中包含了不同模板DNA 的信息。這種交錯延伸過程繼續(xù)進行, 直到獲得全長的基因。

StEP 在效果上與DNA shuffling 技術(shù)是類似的, 但與之相比省去了用DNA 酶切割成片段的過程, 因而更為簡便。StEP 技術(shù)的關(guān)鍵在于找到一個可以使引物退火(T退火>Tm -25 ℃)但又降低聚合酶反應(yīng)速率或降低延伸溫度的反應(yīng)條件, 使得片段可以隨機雜交到包含不同突變的模板上。

無PCR的shuffling該方法利用一些限制性內(nèi)切酶(如Fok 和Bbv 等), 其識別位點位于切割位點上游或者下游若干堿基處, 對親本序列切割后生成的黏端通常是各不相同且非回文序列的黏端, 酶切后用連接酶連接, 得到順序正確的重組裝基因文庫。該方法由王強等于2004 年提出, 他們構(gòu)建了一個微型shuffling 文庫, 其親本分別為人組織型纖溶酶原激活劑(tissueplasminogen activator , tPA)基因以及含有7 個突變位點的tPA 基因。此方法操作相對簡便, 然而, 因為只有能產(chǎn)生彼此不同且非回文序列黏端的內(nèi)切酶可以使用, 此方法受到內(nèi)切酶酶切位點特異性的限制, 使得DNA 片段化的隨機性較低, 還需要進一步完善。

SCRATCHSCRATCH 技術(shù)是DNA shuffling 與ITCHY (Incremental truncationfor the creation of hybrid enzymes, 產(chǎn)生雜交酶的增加平截技術(shù))相結(jié)合而產(chǎn)生的技術(shù), 先將兩個相關(guān)酶基間經(jīng)單酶切打開一個切口, 為外切酶Exo Ⅲ 提供作用位點, Exo Ⅲ 每隔一定時間(如30s)取一次樣、滅活。然后將兩基因的酶解產(chǎn)物混合,平端連接, 生成ITCHY 庫, 再以ITCHY 庫作為親本進行DNAshuffling 。

一般來說, DNA shuffling 不能用于改組同源性低于70% ～80%的基因, 而SCRATCH 具有不依賴基因序列的同源性而產(chǎn)生多個DNA 雜交位點的特點。

RACHITTRACHITY(Random Chimeragenesis on Transient Templates , 過渡模板隨機嵌合技術(shù))將某一親本基因作為臨時DNA 模板, 將另一親本基因(不同種或?qū)?進行酶切與臨時模板進行雜交,然后退火延伸連接成新鏈, 此時由于錯配或疊交將產(chǎn)生突變,形成突變基因庫。較目前報道的體外重組而言, RACHITT 是雜交次數(shù)最多的方法, 可以減少重排片斷的大小, 并增加每個基因的重組機率。

體外exon shuffling體外exon shuffling是模擬自然界外顯子洗牌的過程, 在建立好的同源基因文庫中, 設(shè)計與各作為模板的同源基因的內(nèi)含子有同源性的嵌合寡核苷酸, 以此作為引物進行擴增, 得到內(nèi)含子-外顯子嵌合的片段, 此后再以擴增產(chǎn)物自身作為引物和模板進行PCR 反應(yīng), 獲得全長突變基因庫。該技術(shù)不局限于某單個基因的范疇, 而是將每個外顯子編碼的折疊結(jié)構(gòu)域作為單位, 因此, 體外exon shuffling 可以將多個不同功能的蛋白作為親本, 產(chǎn)生不同特性的突變基因庫,引入更多的理性設(shè)計。

應(yīng)用生物制藥抗生素是生物醫(yī)藥的主要產(chǎn)品之一。但大量使用的結(jié)果導(dǎo)致病菌耐藥性的增強。1998年,Crameri等選用四個編碼頭胞霉素的基因進行DNAfamilyshuffling的改造提高的表達量比野生型的高34-68倍。Yano等在改造大腸桿菌對青霉素的抗性時也獲得了對其他抑制細胞壁形成的藥物的抗性。在疫苗和抗體;細胞因子;生長因子等方面也得到了應(yīng)用。

工業(yè)工業(yè)用酶常需表達量高,活性強,能耐酸堿等極端環(huán)境?？莶菥貋碜钥莶輻U菌是一種具有商業(yè)價值的絲氨酸水解酶。在改造后在對底物的活性、溫度敏感性、溶劑穩(wěn)定性和pH值的依賴性都優(yōu)于最佳親本。提高工業(yè)上的其他酶類如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、漆酶、纖維素酶等在非生物環(huán)境下的穩(wěn)定性,特異性。

育種反轉(zhuǎn)錄病毒是人類基因治療的一種載體,但用常規(guī)培養(yǎng)工藝需將濃度提高100倍,因此常用超速離心等物理方法。但反轉(zhuǎn)錄病毒在這些方法中極不穩(wěn)定,而喪失活性,這可能與病毒外殼蛋白組分有關(guān)。小鼠C型反轉(zhuǎn)錄病毒外殼蛋白由兩個亞基SU(gP70)和TM(PISE)組成,它們負責(zé)與細胞受體結(jié)合并與質(zhì)膜融合。SU和TM是由不穩(wěn)定的二硫鍵結(jié)合在一起的,反轉(zhuǎn)錄病毒的不穩(wěn)定性是因為SU結(jié)構(gòu)域的喪失。用DNAshuming的方法得到一批含復(fù)雜成分的重組外殼蛋白,并對超速離心具有抗性、穩(wěn)定性高于親本30-100倍的新病毒系。同樣使用該方法得到了新的牛痘疫苗。

農(nóng)業(yè)Cigan等改造了從Pentadethra這種植物中獲得殺蟲基因獲得了新的pentin-l殺蟲基因,并申請了專利。Mepherson等則用DNA shuffiing等技術(shù)改善蛋白酶抑制劑的性質(zhì)從而對廣泛的線蟲種群有很好的抗性。

環(huán)境工程將一個可以把除草劑“勞去凈”脫氯的蛋白質(zhì)經(jīng)過多輪DNA shuffiing和篩選得到一個有n個氨基酸突變的新基因,用于城市污水處理系統(tǒng)。Kumamaru等在1998年和Fumkawa等在1995年通過改造降解PCB(多氯聯(lián)苯)的代謝途徑中的一些酶類來提高降解能力和范圍3。