[科普中國(guó)]-肉毒梭菌檢測(cè)

肉毒桿菌是一種生長(zhǎng)在缺氧環(huán)境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封腌漬食物中具有極強(qiáng)的生存能力，它在繁殖過(guò)程中所分泌的肉毒毒素具有極強(qiáng)的毒性，是KCN毒性的一萬(wàn)倍。純化結(jié)晶的肉毒毒素1mg能殺死2億只小鼠，對(duì)人的致死劑量約0.1μg。它通過(guò)阻斷人體神經(jīng)接頭，導(dǎo)致全身麻痹、癱瘓，嚴(yán)重時(shí)能引起人呼吸肌麻痹，導(dǎo)致無(wú)法呼吸，最終死亡。目前報(bào)道新西蘭恒天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染，多家產(chǎn)品被卷入其中，科標(biāo)化工分析檢測(cè)中心為了我國(guó)奶粉質(zhì)量安全，現(xiàn)開(kāi)展食品中肉毒桿菌檢測(cè)。
科標(biāo)化工分析檢測(cè)中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、SN等標(biāo)準(zhǔn)完成食品、微生物、飼料、藥品、紡織品、農(nóng)業(yè)、高分子材料、生物產(chǎn)品、建筑材料以及微生物產(chǎn)品理化性能、力學(xué)性能、電氣性能等測(cè)試。中心通過(guò)了中國(guó)國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)的二合一（CMA、CNAS）實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可，能出具權(quán)威的第三方檢測(cè)報(bào)告。

食品中肉毒桿菌檢測(cè)(PCR檢測(cè)方法)一、實(shí)驗(yàn)原理科標(biāo)化工分析檢測(cè)中心結(jié)合國(guó)標(biāo)GB/T4789.12-2003食品中衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒桿菌及內(nèi)毒素檢驗(yàn)和SN/T2525-2010食品中肉毒桿菌的PCR檢測(cè)方法對(duì)食品中肉毒桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)。
將樣品經(jīng)增菌后劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)物用DNA提取試劑盒抽提DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物中是否含有肉毒桿菌的的特征條帶，從而對(duì)食品中是否污染肉毒桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)。

二、試驗(yàn)方法1、樣品的增菌培養(yǎng)
2、培養(yǎng)物分離
3、DNA提取、擴(kuò)增

四、結(jié)果判定陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶則判定為PCR結(jié)果陽(yáng)性，科標(biāo)化工分析檢測(cè)中心報(bào)告“檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶則判定為PCR結(jié)果為陰性，科標(biāo)化工分析檢測(cè)中心報(bào)告“未檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。

附圖1、PCR擴(kuò)增儀

2、凝膠成像系統(tǒng)

3、厭氧培養(yǎng)箱

4、PCR擴(kuò)增圖譜

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)1 主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)。

2 引用標(biāo)準(zhǔn)GB4789.28 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑

3 檢驗(yàn)程序肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序如下：
注：①報(bào)告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。
②報(bào)告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。
③報(bào)告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。
如上所示，檢樣經(jīng)均質(zhì)處理后，及時(shí)接種培養(yǎng)，進(jìn)行增菌、產(chǎn)毒，同時(shí)進(jìn)行毒素檢測(cè)試驗(yàn)。毒素檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果可證明檢樣中有無(wú)肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
對(duì)增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物，一方面做一般的生長(zhǎng)特性觀察，同時(shí)檢測(cè)肉毒毒素的產(chǎn)生情況。所得結(jié)果可證明檢樣中有無(wú)肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)所得純菌株進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測(cè)，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。

6操作步驟6.1 肉毒毒素檢測(cè)
6.1.1 檢出試驗(yàn)
6.1.2 確證試驗(yàn)
6.1.3 毒力測(cè)定
6.1.4 定型試驗(yàn)
注：①未經(jīng)胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗(yàn)或確證試驗(yàn)若為陽(yáng)性結(jié)果，則胰酶激活處理液可省略毒力測(cè)定及定型試驗(yàn)。
②為爭(zhēng)取時(shí)間盡快得出結(jié)果，毒素檢測(cè)的各項(xiàng)試驗(yàn)也可同時(shí)進(jìn)行。
②根據(jù)具體條件和可能性，定型試驗(yàn)可酌情先省略C、D、F及G型。
④進(jìn)行確證及定型等中和試驗(yàn)時(shí)，檢樣的稀釋?xiě)?yīng)參照所用肉毒診斷血清的效價(jià)。
⑤試驗(yàn)動(dòng)物的觀察可按陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)隨時(shí)結(jié)束，以縮短觀察時(shí)間；唯有出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，應(yīng)保留充分的觀察時(shí)間。
6.2 肉毒梭菌檢出(增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗(yàn))
6.3 分離培養(yǎng)
6.3.1 毒素檢測(cè)：試驗(yàn)方法同4.1。
6.3.2 培養(yǎng)特性檢查
注：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預(yù)溫37℃(流質(zhì)蜂蜜)，或52～53℃(晶質(zhì)蜂蜜)，充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶Q取20g，溶于100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉淀，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培養(yǎng)基(8～10mL)各1支，分別在30℃及37℃下厭?跖嘌?d，按6.2進(jìn)行肉毒毒素檢測(cè)。

檢測(cè)研究進(jìn)展一、生理生化檢測(cè)技術(shù)1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法

2、細(xì)菌培養(yǎng)法

3、孢子培養(yǎng)法

二、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)1、膠體金免疫層析法

2、乳膠凝集法

3、酶免疫法

4、電化學(xué)發(fā)光免疫法

三、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR)

2、熒光定量PCR

3、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法

4、PCR－DHPLC3

肉毒中毒的預(yù)防肉毒中毒的預(yù)防，主要是加強(qiáng)食品的衛(wèi)生管理監(jiān)督。對(duì)病人應(yīng)盡早根據(jù)癥狀作出診斷，迅速注射A、B、E三型多價(jià)抗毒素。若毒素型別已定，可注射相應(yīng)的抗毒索；直至癥狀消失。同時(shí)要加強(qiáng)護(hù)理，對(duì)癥治療，特別注意預(yù)防呼吸肌的麻痹和窒息，控制呼吸道的繼發(fā)感染。嬰兒肉毒病的治療是幫助通氣呼吸，及維持營(yíng)養(yǎng)等支持療法，抗生素和抗毒素不但無(wú)效，可能還有害。因?yàn)槭褂昧丝股睾螅c內(nèi)大量的肉毒桿菌突然死亡，毒素釋放被短期內(nèi)大量吸收后會(huì)加重病情。4