[科普中國]-肉毒梭菌檢測

肉毒桿菌是一種生長在缺氧環(huán)境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封腌漬食物中具有極強的生存能力，它在繁殖過程中所分泌的肉毒毒素具有極強的毒性，是KCN毒性的一萬倍。純化結(jié)晶的肉毒毒素1mg能殺死2億只小鼠，對人的致死劑量約0.1μg。它通過阻斷人體神經(jīng)接頭，導致全身麻痹、癱瘓，嚴重時能引起人呼吸肌麻痹，導致無法呼吸，最終死亡。目前報道新西蘭恒天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染，多家產(chǎn)品被卷入其中，科標化工分析檢測中心為了我國奶粉質(zhì)量安全，現(xiàn)開展食品中肉毒桿菌檢測。
科標化工分析檢測中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、SN等標準完成食品、微生物、飼料、藥品、紡織品、農(nóng)業(yè)、高分子材料、生物產(chǎn)品、建筑材料以及微生物產(chǎn)品理化性能、力學性能、電氣性能等測試。中心通過了中國國家認證認可監(jiān)督管理委員會和中國合格評定國家認可委員會的二合一（CMA、CNAS）實驗室認證認可，能出具權(quán)威的第三方檢測報告。

食品中肉毒桿菌檢測(PCR檢測方法)一、實驗原理科標化工分析檢測中心結(jié)合國標GB/T4789.12-2003食品中衛(wèi)生微生物學檢驗肉毒桿菌及內(nèi)毒素檢驗和SN/T2525-2010食品中肉毒桿菌的PCR檢測方法對食品中肉毒桿菌進行檢驗。
將樣品經(jīng)增菌后劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)培養(yǎng)基培養(yǎng)，對培養(yǎng)物用DNA提取試劑盒抽提DNA，進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物中是否含有肉毒桿菌的的特征條帶，從而對食品中是否污染肉毒桿菌進行快速檢測。

二、試驗方法1、樣品的增菌培養(yǎng)
2、培養(yǎng)物分離
3、DNA提取、擴增

四、結(jié)果判定陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預期大小的擴增條帶，待測樣品出現(xiàn)預期大小的擴增條帶則判定為PCR結(jié)果陽性，科標化工分析檢測中心報告“檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。待測樣品未出現(xiàn)預期大小的擴增條帶則判定為PCR結(jié)果為陰性，科標化工分析檢測中心報告“未檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。

附圖1、PCR擴增儀

2、凝膠成像系統(tǒng)

3、厭氧培養(yǎng)箱

4、PCR擴增圖譜

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗1 主題內(nèi)容與適用范圍本標準規(guī)定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗方法。
本標準適用于食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2 引用標準GB4789.28 食品衛(wèi)生微生物學檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑

3 檢驗程序肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序如下：
注：①報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。
②報告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。
③報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。
如上所示，檢樣經(jīng)均質(zhì)處理后，及時接種培養(yǎng)，進行增菌、產(chǎn)毒，同時進行毒素檢測試驗。毒素檢測試驗結(jié)果可證明檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
對增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物，一方面做一般的生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素的產(chǎn)生情況。所得結(jié)果可證明檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進行分離培養(yǎng)，對所得純菌株進行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。

6操作步驟6.1 肉毒毒素檢測
6.1.1 檢出試驗
6.1.2 確證試驗
6.1.3 毒力測定
6.1.4 定型試驗
注：①未經(jīng)胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結(jié)果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
②為爭取時間盡快得出結(jié)果，毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
②根據(jù)具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。
④進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應(yīng)參照所用肉毒診斷血清的效價。
⑤試驗動物的觀察可按陽性結(jié)果的出現(xiàn)隨時結(jié)束，以縮短觀察時間；唯有出現(xiàn)陰性結(jié)果時，應(yīng)保留充分的觀察時間。
6.2 肉毒梭菌檢出(增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗)
6.3 分離培養(yǎng)
6.3.1 毒素檢測：試驗方法同4.1。
6.3.2 培養(yǎng)特性檢查
注：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預溫37℃(流質(zhì)蜂蜜)，或52～53℃(晶質(zhì)蜂蜜)，充分攪拌后立即稱取20g，溶于100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉淀，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培養(yǎng)基(8～10mL)各1支，分別在30℃及37℃下厭?跖嘌?d，按6.2進行肉毒毒素檢測。

檢測研究進展一、生理生化檢測技術(shù)1、動物實驗法

2、細菌培養(yǎng)法

3、孢子培養(yǎng)法

二、免疫學檢測技術(shù)1、膠體金免疫層析法

2、乳膠凝集法

3、酶免疫法

4、電化學發(fā)光免疫法

三、分子生物學檢測技術(shù)1、聚合酶鏈式反應(yīng)( PCR)

2、熒光定量PCR

3、環(huán)介導等溫核酸擴增法

4、PCR－DHPLC3

肉毒中毒的預防肉毒中毒的預防，主要是加強食品的衛(wèi)生管理監(jiān)督。對病人應(yīng)盡早根據(jù)癥狀作出診斷，迅速注射A、B、E三型多價抗毒素。若毒素型別已定，可注射相應(yīng)的抗毒索；直至癥狀消失。同時要加強護理，對癥治療，特別注意預防呼吸肌的麻痹和窒息，控制呼吸道的繼發(fā)感染。嬰兒肉毒病的治療是幫助通氣呼吸，及維持營養(yǎng)等支持療法，抗生素和抗毒素不但無效，可能還有害。因為使用了抗生素后，腸內(nèi)大量的肉毒桿菌突然死亡，毒素釋放被短期內(nèi)大量吸收后會加重病情。4