[科普中國(guó)]-肉與肉制品：維生素B2含量測(cè)定

高效液相色譜法原理

試樣用稀酸經(jīng)121℃～123℃高壓釜處理，提取維生素B2（核黃素），過(guò)濾后，用高效液相色譜儀測(cè)定儀，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

試劑如無(wú)特別說(shuō)明，所有世紀(jì)均為分析純。

（1）水：符合GB/T 6682-2008規(guī)定的一級(jí)水。

（2）冰乙酸。

（3）甲醇：色譜純huo經(jīng)重蒸。

（4）鹽酸溶液（0.1mol/L）：吸取2.1mL鹽酸（ρ20≈1.19g/mL）,用水稀釋至250mL，混勻。

（5）氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取10g氫氧化鈉，溶于水中，用水稀釋至250mL。

（6）乙酸溶液（0.02mol/L）：吸取1.14mL冰乙酸，用水稀釋至1L。

（7）乙酸鈉溶液（0.05mol/L）：稱取3.4g三水乙酸鈉，溶于水中，用水稀釋至500mL，冰乙酸調(diào)pH為4.5。

（8）精密pH試紙：范圍3.8-5.4。

（9）維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100ug/mL）：稱取50.0mg維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸溶液（0.02mol/L）溶解，并至500mL定容棕色容量瓶中（可在水浴上加熱溶解，冷卻后再定容）。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.5ug/mL）：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100ug/mL）1.00mL于100mL棕色容量瓶中，用乙酸溶液（0.02mol/L）定容，混勻，吸取此溶液5.00mL于100mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，臨用時(shí)配置。

儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器及下列儀器。

（1）機(jī)械設(shè)備：用于試樣的均質(zhì)化，包括高速旋轉(zhuǎn)的切割機(jī)，或多孔板的孔徑不超過(guò)4mm的絞肉機(jī)。

（2）高壓釜：溫度可控制在121℃～123℃。

（3）高效液相色譜儀：帶紫外或熒光檢測(cè)器。

取樣實(shí)驗(yàn)室所收到的樣品應(yīng)具有代表性且在運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中無(wú)受損或發(fā)生變化。

取樣方法參見(jiàn)GB∕T 9695.19。

取有代表性的樣品200 g。

試樣制備使用適當(dāng)?shù)臋C(jī)械設(shè)備將試樣均質(zhì)。注意避免試樣的溫度超過(guò)25℃。若使用絞肉機(jī)，試樣至少通過(guò)該設(shè)備兩次。

將試樣裝入密封的容器里，防止變質(zhì)和成分變化。試樣應(yīng)在均質(zhì)化后24 h內(nèi)盡快分析。

分析步驟（1）試樣處理

稱取試樣5 g（準(zhǔn)確至0.001 g）于250 mL具塞錐形瓶中，加入鹽酸溶液（4.4）10 mL，塞好瓶蓋，用力振搖。用鹽酸溶液沖洗瓶壁，總體積約為60 mL。將錐形瓶放人121℃～123℃高壓釜中加熱30 min，取出冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為4.0～4.5，使蛋白質(zhì)沉淀后，轉(zhuǎn)移至500 mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，過(guò)濾，濾液避光備用。濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

（2）測(cè)定

液相色譜參考條件

a）色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），或相當(dāng)者；

b）流動(dòng)相：甲醇+0.05 moI/L乙酸鈉溶液（pH 4.5）=35+65（體積比）；

c）流速：1.0 mL/min；

d）柱溫：30℃；

e）檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)為440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm；

f）進(jìn)樣量：20 μL。

根據(jù)試樣溶液中的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液中維生素B2的響應(yīng)維生素B2值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液等體積間隔進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖參見(jiàn)附圖。

（3）平行試驗(yàn)

按試樣處理和分析步驟對(duì)同一試樣進(jìn)行測(cè)定。

（4）空白實(shí)驗(yàn)

除不加入試樣外，均按試樣處理和分析步驟進(jìn)行測(cè)定。

計(jì)算式中：

X：試樣中維生素B2的含量（mg/100g）；

c：標(biāo)準(zhǔn)工作液中維生素B2的濃度（ug/mL）；

A：試樣中維生素B2的峰面積；

V：試樣溶液的最終定容體積（mL）；

Ai：標(biāo)準(zhǔn)工作液中生素B2的峰面積；

m：試樣質(zhì)量（g）。

計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白，結(jié)果準(zhǔn)確至0.01mg/100g。

精密度同一分析者在同一實(shí)驗(yàn)室采用相同的方法和相同的儀器，在短時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)同一樣品獨(dú)立測(cè)定兩次，兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。1

比色法原理試樣用稀酸經(jīng)121℃～123℃高壓釜處理，提取維生素B2（核黃素），維生素B2在中性或酸性溶液中經(jīng)照射產(chǎn)生藍(lán)色熒光，熒光強(qiáng)度與維生素B2的濃度成正比，以此測(cè)定維生素B2的含量。

試劑如無(wú)特別說(shuō)明，所有世紀(jì)均為分析純。

（1）水：符合GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水。

（2）連二亞硫酸鈉。

（3）高錳酸鉀溶液（40g/L）：稱取4g高錳酸鉀，溶于水中用水稀釋至100mL。

（4）3%過(guò)氧化氫溶液：取10mL 30%過(guò)氧化氫，用水稀釋至100m。

（5）冰乙酸

（6）鹽酸溶液（0.1mol/L）：吸取2.1mL鹽酸（ρ20≈1.19g/mL）,用水稀釋至250mL，混勻。

（7）氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取10g氫氧化鈉，溶于水中，用水稀釋至250mL。

（8）乙酸溶液（0.02mol/L）：吸取1.14mL冰乙酸，用水稀釋至1L。

（9）精密pH試紙：范圍3.8-5.4。

（10）維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100ug/mL）：稱取50.0mg維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸溶液（0.02mol/L）溶解，并至500mL定容棕色容量瓶中（可在水浴上加熱溶解，冷卻后再定容）。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.5ug/mL）：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100ug/mL）1.00mL于100mL棕色容量瓶中，用乙酸溶液（0.02mol/L）定容，混勻，吸取此溶液5.00mL于100mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，臨用時(shí)配置。

儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器及下列儀器。

（1）熒光分光光度計(jì)。

（2）機(jī)械設(shè)備：用于試樣的均質(zhì)化，包括高速旋轉(zhuǎn)的切割機(jī)，或多孔板的孔徑不超過(guò)4mm的絞肉機(jī)。

（3）高壓釜：溫度可控制在121℃～123℃。

取樣實(shí)驗(yàn)室所收到的樣品應(yīng)具有代表性且在運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中無(wú)受損或發(fā)生變化。

取樣方法參見(jiàn)GB∕T 9695.19。

取有代表性的樣品200 g。

試樣制備使用適當(dāng)?shù)臋C(jī)械設(shè)備將試樣均質(zhì)。注意避免試樣的溫度超過(guò)25℃。若使用絞肉機(jī)，試樣至少通過(guò)該設(shè)備兩次。

將試樣裝入密封的容器里，防止變質(zhì)和成分變化。試樣應(yīng)在均質(zhì)化后24 h內(nèi)盡快分析。

分析步驟（1）試樣處理

稱取試樣5 g（準(zhǔn)確至0.001 g）于250 mL具塞錐形瓶中，加入鹽酸溶液（4.4）10 mL，塞好瓶蓋，用力振搖。用鹽酸溶液沖洗瓶壁，總體積約為60 mL。將錐形瓶放人121℃～123℃高壓釜中加熱30 min，取出冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為4.0～4.5，使蛋白質(zhì)沉淀后，轉(zhuǎn)移至500 mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，過(guò)濾，濾液避光備用。濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

（2）測(cè)定

吸取備用濾液和維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.5ug/mL）各10.0mL，分別置于兩支25mL棕色試管中，加入冰乙酸1.00mL。在不斷搖動(dòng)下加入高錳酸鉀溶液（40g/L）4滴，使溶液顯紫色，靜置2min，滴加過(guò)氧化氫溶液兩滴，搖勻，使紫色在10s內(nèi)褪去。

于激發(fā)波長(zhǎng)440nm，發(fā)射波長(zhǎng)565nm處，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度I和I`。

在各試管中分別加入二亞硫酸鈉20mg，輕搖，10s內(nèi)測(cè)其最小熒光強(qiáng)度Q和Q`。

計(jì)算

X：試樣中維生素B2的含量（mg/100g）；

I：試樣溶液的熒光強(qiáng)度；

Q：試樣溶液加連二亞硫酸鈉后的熒光強(qiáng)度；

I`：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液的熒光強(qiáng)度；

Q'：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液加連二亞硫酸鈉后的熒光強(qiáng)度；

c：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度（ug/mL）；

m：試樣質(zhì)量（g）。

計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確至0.01mg/100g。

精密度同一分析者在同一實(shí)驗(yàn)室采用相同的方法和相同的儀器，在短時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)同一樣品獨(dú)立測(cè)定兩次，兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。1