[科普中國]-肉與肉制品氯霉素含量的測定

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了畜禽肉中氯霉素的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于畜禽肉中氯霉素的測定。

本標(biāo)準(zhǔn)檢出限：氣相色譜-質(zhì)譜法，檢出限為0.2ug/kg；酶聯(lián)免疫法為0.05ug/kg。1

規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過GB/T9695本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。

GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(GB/T6682— 2008，ISO3696：1987，MOD)。

GB/T9695.19 肉與肉制品 取樣方法。1

氣相色譜-質(zhì)譜法(確證法)原理樣品中氯霉素用乙酸乙酯提取，脂肪用正己烷去除，經(jīng)C18凈化，BSTFA+TMCS(99+1）衍生后，用NCI源選擇印m/z為466的特征離子為目標(biāo)離子，在SIM模式下進(jìn)行GC-MS測定。

試劑和材料若無特別說明，所用試劑均為分析純，所用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。

氯霉素：標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥ 99%。

甲醇：色譜純。

三氯甲烷

正己烷：色譜純。

乙酸乙酯。

無水硫酸鈉。

氯化鈉。

N、O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFΛ )。

三甲基氯硅烷(TMCS)。

丙酮：色譜純。

甲苯。

甲醇溶液：甲醇+水=2+8。

氯化鈉溶液(40g/L)：稱取4.00g氯化鈉，用水溶解，定容至100mL。

甲醇一氯化鈉溶液：量取甲醇溶液20mL、氯化鈉溶液80mL，混勻。

混合衍生劑：N、O-雙三甲基硅烷dg 氟乙酰胺+三甲基氯硅烷=99+1。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(c=0.1mg/mL)：稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.0001g)，用丙酮溶解并定容至100mL。儲備液貯存在4℃ 冰箱中，可使用兩個(gè)月。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)試驗(yàn)需要，用丙酮稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備及下列儀器。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC- MS)。

分析天平：可準(zhǔn)確稱重至0.0001g。

分析天平：可準(zhǔn)確稱重至0.01g。

離心機(jī)：5500r/min。

渦旋儀。

同相萃取裝置。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

均質(zhì)器。

振蕩器。

機(jī)械設(shè)備：用于試樣的均質(zhì)。包括：絞肉機(jī)、斬拌機(jī)等肉類組織粉碎機(jī)。

氮吹儀。

具塞離心管：50mL、10mL。

C18固相萃取柱或相當(dāng)者：200mg，3mL。

分析步驟試樣液制備

試樣的制備

按GB/T9695.19規(guī)定的方法取樣。至少取有代表性的試樣200g，使用適當(dāng)?shù)臋C(jī)械設(shè)備將試樣均質(zhì)。均質(zhì)后的試樣盡快分析，否則，應(yīng)密封低溫貯存，防止試樣變質(zhì)或成分發(fā)生變化。貯存的試樣在啟用時(shí)，應(yīng)重新混勻。

提取

稱取10g樣品(精確至0.01g)置于50mL具塞離心管中，加人少量無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯均質(zhì)1min，以5000r/min離心5min后，用吸管吸出上層乙酸乙酯于濃縮瓶中，殘?jiān)偌尤胍宜嵋阴?5mL重復(fù)提取樣品，合并提取液。提取液在50℃ 水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙酸乙酯，加入l mL甲醇-氯化鈉溶液和4mL正己烷，充分振搖后，轉(zhuǎn)移至10mL具塞離心管中，用1mL甲醇-氯化鈉溶液清洗濃縮瓶，合并清洗液于10mL具塞離心管中。渦旋0.5min，經(jīng)3000r/min離心3min后，用吸管吸去正己烷，加人4mL正己烷重復(fù)上述操作。然后在離心管中加人4mI乙酸乙酯，渦旋1min，經(jīng)3000r/min離心3min后，用吸管吸出乙酸乙酯，加入4mL乙酸乙酯重復(fù)上述操作，合并乙酸乙酯于濃縮瓶中，在50℃ 水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用5mL水溶解殘?jiān)?/p>

凈化

依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、5mL水活化C18固相萃取柱，然后加人上述步驟得到的提取液，加5mL甲醇+水淋洗色譜柱，用25mL甲醇洗脫于濃縮瓶中，洗脫液在50℃ 下濃縮至近干。用100uL甲醇溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至10mL具塞離心管中，再用甲醇沖洗濃縮瓶，合并洗液，于50℃ 下用氮?dú)獯蹈伞?/p>

衍生化

于吹干的試樣殘?jiān)屑尤?00uL甲苯和100uL混合衍生劑，蓋緊塞后，渦旋混勻1min，60℃ 下反應(yīng)30min，然后在50℃ 下用氮?dú)獯蹈?，加?mL正己烷溶解殘?jiān)?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作液制備

配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液按“衍生化”步驟進(jìn)行操作。

空白液制備

除不稱取試樣外，均按“試樣液制備”步驟進(jìn)行操作。

測定

氣相色譜-質(zhì)譜法測定條件

色譜柱：DB-5MS(30m× 0.25mm× 0.25um)石英毛細(xì)管柱或相當(dāng)者；

載氣：氦氣，純度≥99.999%；

流速：1，65mL/min；

進(jìn)樣口溫度：250℃ ；

進(jìn)樣量：1uL；

進(jìn)樣方式：無分流(保持1min)進(jìn)樣；

柱溫程序：初始55℃ ，保持1min，以25℃ /min速度升至280℃ ，保持6min；

NCI源：70eV；

離子源溫度：150℃ ；

接口溫度：280℃ ；

溶劑延遲：7min；

反應(yīng)氣：甲烷，純度≥99.99%；

選擇離子檢測：

|| ||

定性測定

進(jìn)行樣品測定時(shí)，如果檢出的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子比與標(biāo)準(zhǔn)樣品衍生物的離子比相一致(各相關(guān)離子比在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的1O%之內(nèi))，則可判斷樣品中存在氯霉素。

定量測定

吸取1uL衍生的試樣液、標(biāo)準(zhǔn)液或空白液注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，以m/z 466為定量離子，標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)試樣液的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出溶液中對應(yīng)的氯霉素濃度值。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對試樣進(jìn)行定量，樣品溶液中氯霉素衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。

在上述色譜條件下，氯霉素衍生物的參考保留時(shí)問為12.58min。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物總離子流圖和質(zhì)譜圖以及氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物選擇離子質(zhì)譜圖參見附錄中的圖A.1、圖A.2、圖A.3。

平行試驗(yàn)

按以上步驟，對同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測定。

結(jié)果計(jì)算按式(1)計(jì)算樣品中氯霉素的含量：

? ? ? ?(1)

式中：

X 一試樣中氯霉素的含量，單位為微克每千克(ug/kg)；

c —從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查得試樣液中氯霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

c0一從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查得空白液中氯霉素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

V 一試樣定容體積，單位為毫升(mL)；

m 一稱取試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。

結(jié)果取算術(shù)平均值，保留三位有效數(shù)字。

精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。1

附 錄氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物的總離子流見圖A1。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物的質(zhì)譜圖見圖A2。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物的選擇離子質(zhì)譜圖見圖A3。