[科普中國(guó)]-肉與肉制品：維生素A含量測(cè)定

原理

樣品皂化后，用石油醚提取不皂化的維生素 A，濃縮后，用高效液相色譜熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm，分離測(cè)定維生素A，用標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法計(jì)算樣品中維生素A的含量。

試劑除特別標(biāo)明外所用試劑全為分析純,所用水應(yīng)為蒸餾水或同等純度的水。
（1）氫氧化鉀(GB 2306)：50%溶液；
（2）抗壞血酸：10%溶液；
（3）無(wú)水乙醇(GB 678)；
（4）石油醚：沸程 30～60℃；
（5）無(wú)水硫酸鈉；
（6）異丙醇；
（7）甲醇(GB 683)：重蒸后使用；
（8）維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.2mg/mL

稱取維生素A標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用異丙醇溶解，移至50mL棕色容量瓶中，用異丙醇稀至刻度。當(dāng)天配制。

儀器和設(shè)備除實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：
（1）絞肉機(jī)：孔徑不超過(guò) 4mm；
（2） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；
（3）液相色譜儀，帶熒光檢測(cè)器；
（4）色譜柱：十八烷基鍵合固定相柱或其他能分離維生素A的柱子。

試樣按照如下方法試樣：
（1）按 GB 9695.19 取樣。
（2）取有代表性的試樣200g，于絞肉機(jī)中至少絞兩次使其混勻，試樣應(yīng)盡快分析。

分析步驟皂化維生素A易被光破壞，試驗(yàn)應(yīng)避光操作。

稱取0.5～5g試樣于150mL棕色皂化瓶中，加入10%抗壞血酸溶液5mL，50%氫氧化鉀溶液15mL，乙醇 30mL，混勻，于80℃水浴上回流加熱30～60min，使試樣溶液清澈，完全皂化后于流水中冷卻。

提取將皂化后的試樣溶液移入125mL分液漏斗中，用30mL石油醚分?jǐn)?shù)次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，塞上塞子，輕搖分液漏斗，避免乳化。靜置，待分層后，將水層放入第二個(gè)分液漏斗中，醚層留在第一個(gè)分液漏斗中。于第二個(gè)分液漏斗中倒入10mL石油醚，進(jìn)行第二次提取，如此進(jìn)行3～4次，石油醚層交入第一個(gè)分液漏斗中。石油醚層反復(fù)用水洗滌，直至水層不呈堿性(用pH試紙檢查)為止，棄去水層。將分液漏斗中石油醚層經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水，濾入干燥的棕色圓底燒瓶中。再用石油醚洗滌無(wú)水硫酸鈉和分液漏斗，洗液并入棕色圓底燒瓶中

分析試樣的準(zhǔn)備將盛有石油醚提取液的圓底燒瓶與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器連接，于50～60℃水浴上減壓回收石油醚，待瓶?jī)?nèi)只剩約1～2mL液體時(shí)，取下燒瓶，用氮?dú)獯蹈墒Ｓ嘁后w，立即加入2.0mL異丙醇溶液，搖勻，溶解瓶中維生素A，塞上塞子，以防溶劑揮發(fā)，此為色譜分析樣液

測(cè)定（1）維生素A標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液 1，2，3，4，5，6，7，8mL進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，記錄峰面積或峰高，以維生素A量為橫坐標(biāo)，峰高或峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

若樣品中維生素A含量很低，可取維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2mg/mL)5mL，用異丙醇溶液定容至50mL容量瓶中，此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.02mg/mL。如前進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）色譜分析參考條件

分析柱：十八烷基鍵合固定相柱式相同效用的柱；
流動(dòng)相：甲醇/水98/2；
流動(dòng)相流速：1 mL/min；
檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器Ex:340nm；
Em：460nm；
進(jìn)樣量：試樣液4～6μL，記錄峰面積或峰高。

分析結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算公式：X=A×1000×V0/V1×m×1000×100

式中：X——樣品中維生素A含量，mg/100g；
A——根據(jù)試樣的峰面積或峰高查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到維生素A的量，μg；
V1——試樣進(jìn)樣分析的體積，μL；
V0——試樣最終稀釋的體積，mL；
m——稱樣質(zhì)量，g。
當(dāng)符合允許差規(guī)定的要求時(shí)，取兩次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值作為結(jié)果。

允許差同一樣品同時(shí)或相繼兩次測(cè)定結(jié)果之差不得超過(guò)平均值的 30%1。