[科普中國]-肉與肉制品：膽固醇含量測定

原理

肉與肉制品中的脂類經(jīng)皂化后，膽固醇作為不皂化物被提取出來，用氣相色譜法測定，外標法定量。

試劑如無特別說明，所用試劑均為分析純。

（1）水：符合GB/T 6682-2008規(guī)定的二級水。

（2）乙醚。

（3）三氯甲烷。

（4）無水乙醇。

（5）無水硫酸鈉。

（6）氫氧化鉀溶液（1 mol/L）：稱取5.6g氫氧化鉀，溶于水中，用水稀釋至100mL。

（7）膽固醇標準品：純度≥95%。

（8）（1m膽固醇標準貯備液g/mL）：稱取膽固醇標準品0.1000g置于100mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容。

（9）膽固醇標準工作液：臨用時將膽固醇標準貯備液用無水乙醇稀釋至所需濃度。

儀器和設(shè)備實驗室常規(guī)儀器及下列儀器。

（1）機械設(shè)備：用于試樣的均質(zhì)化，包括高速旋轉(zhuǎn)的切割機，或多孔板的孔徑不超過4mm的絞肉機。

（2）氣相色譜儀：配毛細管柱和FID檢測器。

（3）電子天平：可準確稱重至1mg。

取樣實驗室所收到的樣品應具有代表性且在運輸和儲藏過程中無受損或發(fā)生變化。

取樣方法參見GB∕T 9695.19。

取有代表性的樣品200 g。

試樣制備使用適當?shù)臋C械設(shè)備將試樣均質(zhì)。注意避免試樣的溫度超過25℃。若使用絞肉機，試樣至少通過該設(shè)備兩次。

將試樣裝入密封的容器里，防止變質(zhì)和成分變化。試樣應在均質(zhì)化后24 h內(nèi)盡快分析。

分析步驟皂化稱取0.2-1.0g（準確至0.001g）試樣，置于50mL具塞試管中，加入1mol/L氫氧化鉀溶液10mL，無水乙醇10mL，混勻，裝上冷凝管，在85～95℃水浴上緩緩皂化1h，至試樣溶液清澈，皂化后用流水冷卻。

提取將皂化后的試樣溶液移入50mL分液漏斗中，加10mL乙醚于分液漏斗中，輕輕振搖，靜置分層，將水層放入上述具塞試管中。加10mL乙醚于具塞試管，輕輕振搖，靜置分層，將乙醚移入上述分液漏斗內(nèi)。再用10mL乙醚于具塞試管，重復提取一次，將乙醚移入上述分液漏斗內(nèi)。

用15mL水分三次洗滌分液漏斗中的溶液。分層后棄去水層，用無水硫酸鈉10g干燥乙醚，將乙醚層移入另一具塞試管中，通氮氣吹干后，加入1.00mL無水乙醇，混勻。

氣相色譜參考條件色譜柱：DB-5彈性石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm），或相當者；

載氣：高純氦，純度≥99.99%；恒流2.4mL/min;

柱溫（程序升溫）：初始溫度為200℃，保持1min，以30℃/min升至280℃，保持10min；

進樣口溫度：280℃；

檢測器溫度：290℃；

進樣量：1uL；

進樣方式：不分流進樣，進樣1min后開閥；

空氣流速：350mL/min；

氫氣流速：30mL/min。

測定根據(jù)試樣溶液中膽固醇的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液。標準工作液和試樣溶液中膽固醇的響應值均應在儀器檢測線性范圍內(nèi)。標準工作液和試樣溶液等體積間隔進樣測定。根據(jù)保留時間定性，外標法定量。標準色譜圖見圖1.

平行試驗按“皂化-測定”，對同一試樣進行平行試驗測定。

空白實驗除不加入試樣外，均按“皂化-測定”進行測定。

計算按下式計算試樣中膽固醇的含量。

式中:

X：樣品中膽固醇含量，mg/100g；

c：標準工作液中膽固醇的濃度ug/mL；

A：試樣溶液中膽固醇的峰面積；

V：試樣溶液最終定容的體積，mL；

As：標準工作液中膽固醇的峰面積；

M：脂肪質(zhì)量，g。

計算結(jié)果應扣除空白，結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。

精密度同一分析者在同一實驗室采用相同的方法和相同的儀器，在短時間間隔內(nèi)對同一樣品獨立測定兩次，兩次測試結(jié)果的絕對差值不得超過10%。1