[科普中國(guó)]-徒手切片法

徒手切片法是指手持刀片將新鮮的或固定的實(shí)驗(yàn)材料切成薄片的制作方法。徒手切片法是指不需要專門的儀器設(shè)備，試樣也不需要特殊的化學(xué)試劑處理，而直接將新鮮的或固定的材料(一般為木質(zhì)化程度較低的植物)切成薄片的方法。

簡(jiǎn)介徒手切片前，應(yīng)先準(zhǔn)備好一個(gè)盛有清水的培養(yǎng)皿。在切片時(shí)，用左手的拇指與食指、中指夾住實(shí)驗(yàn)材料，大拇指應(yīng)低于食指2～3mm，以免被刀片割破。材料要伸出食指外約2～3mm，左手拿材料要松緊適度，右手平穩(wěn)地拿住刀片并與材料成垂直。然后，在材料的切面上均勻地滴上清水，以保持材料濕潤(rùn)。將刀口向內(nèi)對(duì)著材料，并使刀片與材料切口基本上保持平行，再用右手的臂力（不要用手的腕力）向自身方向拉切。此時(shí)，左手的食指一側(cè)應(yīng)抵住刀片的下面，使刀片始終平整。連續(xù)地切下數(shù)片后，將刀片放在培養(yǎng)皿的水中稍一晃動(dòng)，切片即漂浮于水中。當(dāng)切到一定數(shù)量后，可在培養(yǎng)皿內(nèi)挑選透明的薄片用低倍鏡觀察檢查。好的切片應(yīng)該是薄且比較透明、組織結(jié)構(gòu)完整，否則要重新進(jìn)行切片。

對(duì)經(jīng)檢查符合要求的切片，如果只作臨時(shí)觀察，可封藏在水中進(jìn)行觀察。若要更清楚地顯示其組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可選擇一些切片進(jìn)一步通過固定、染色、脫水、透明及封藏等步驟，做成永久玻片標(biāo)本。

徒手切片技巧如果不想切斜，要注意兩點(diǎn)，一個(gè)是左手拿的露出來那截要短，盡量只能連續(xù)切2刀的樣子(一般是可以切4，5刀的），一個(gè)是切口一定要水平，同時(shí)右手的刀片也要水平，拉刀的時(shí)候保持在一個(gè)平面上（拉快點(diǎn)容易做到）。這是根和莖的切法，不過每次的量會(huì)有所減少。對(duì)于葉，有三種切法，一個(gè)是直接切；一個(gè)是卷成管狀，當(dāng)莖來切；還有就是用三層刀片夾起來。其中，第一種適合于裸子植物那種針葉，方法要領(lǐng)和上面說的差不多；第二種適合于比較軟的葉片，要領(lǐng)是要卷的細(xì)，中間的洞不要太大（大了容易斜）；第三種適用于比較堅(jiān)韌，硬的葉片，絕對(duì)要放在載玻片之類的地方，要用劃的，凌空切會(huì)很不順，容易切不斷。還有一種特殊的方法是切成小塊的先，再夾到蘿卜里面（事先挖個(gè)洞或切條槽），再一起切，這個(gè)適用于全部，根莖葉，軟的硬的均可（就是那種針葉不太好用它，我都切不好）。所以克服柔軟就是要注意，想辦法使它變厚變硬（對(duì)葉：卷，夾，或者墊玻璃；對(duì)根莖，夾，或者用左手捏緊一點(diǎn)，捏上面一點(diǎn)，使它不會(huì)晃）。至于彎曲，我覺得不用太在意，要么舍棄掉這一段，要么用手壓緊，關(guān)鍵只是上面要平。還有，如果切含有楞或者有葉脈的部分，一定要從這些地方開始切，先切硬的部分（朝向刀口）。平時(shí)切兩到三層差不多，一層的細(xì)胞會(huì)破損，有空洞；這樣也比較適合染色。

徒手切片的優(yōu)缺點(diǎn)徒手切片是用手持雙面刀片或剃刀，將新鮮材料或預(yù)先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不經(jīng)染色或經(jīng)簡(jiǎn)單染色后，用水封片作臨時(shí)裝片觀察。徒手切片法的優(yōu)點(diǎn)是不需要復(fù)雜的設(shè)備，方法簡(jiǎn)便，制片迅速，而且能觀察到植物組織的自然色澤和活體結(jié)構(gòu)，常用于研究植物解剖結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組織化學(xué)成分，植物資源鑒定等。同時(shí)，它具有利于臨時(shí)觀察、能夠較快的得到結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是對(duì)于體積過小、太軟、太硬的材料則難于切片，而且不能制成連續(xù)切片。1

徒手切片法在進(jìn)口材木材識(shí)別中的應(yīng)用研究背景木材作為一種生物質(zhì)材料，存在較大的變異性，同一樹種間甚至同株不同部位的木材特性都會(huì)表現(xiàn)出較大的差異。但木材微觀構(gòu)造特征中，這種差異則相對(duì)較小。通過對(duì)木材微觀結(jié)構(gòu)觀察識(shí)別鑒定，其準(zhǔn)確度與可信度都非常高。隨著進(jìn)口材增多，由木材名稱混亂而帶來的糾紛也越來越多。木材識(shí)別不僅是解決該類糾紛的有效途徑，而且可為確定樹種名稱、辨別樹種真?zhèn)?、幫助尋找代用材料、為干燥及涂飾等加工工藝的制訂提供參考依?jù)。但由于大多數(shù)進(jìn)口材材質(zhì)較為堅(jiān)硬，內(nèi)含物較豐富，有些甚至富含晶體或硅石，采用常規(guī)的切片方法，不僅需要較長(zhǎng)的軟化時(shí)間，其軟化尺度也很難把握，軟化不好則很難得到滿意的切。此外，由于處理糾紛需有一定的時(shí)效性，快速準(zhǔn)確的得出鑒定結(jié)論顯得尤為重要。徒手切片法在木質(zhì)化程度較高的木材中的應(yīng)用只是在文獻(xiàn)中簡(jiǎn)單提到，而具體的操作方法尚未見報(bào)道。筆者在實(shí)踐中嘗試采用徒手切片法進(jìn)行樹種鑒定，不僅可保證結(jié)論的準(zhǔn)確可靠，而且也滿足了快速高效及低成本的要求。

工具的選擇與制作切片工具的好壞直接關(guān)系到木材切片質(zhì)量的高低，因此，要求切片刀平整、鋒利，并具有較大硬度，通常利用高速鋼機(jī)用鋸條的邊角料，其形狀以方便手握切削為宜。刃口尺寸一般小于 20 mm，其目的是減小切削阻力。切片刀通常采用比較傳統(tǒng)的手工磨刀方法，一般可制成單面刃磨刀片，研磨角θ=15～ 30°，研磨角小，刀刃較為鋒利，但耐久性較差，容易產(chǎn)生豁口，研磨角大則剛性大，適宜于切削硬重的木材，如鐵樟(Eusideroxylon zwageri)、重坡壘(Hopeaspp.)等。

切片與裝片與常規(guī)切片相比，徒手切片很難切出很規(guī)整的切片，故不便作為木材解剖性質(zhì)如徑向變異性的研究依據(jù)，但適宜進(jìn)行木材微觀特征的觀察與記載。因此，切片時(shí)無須要求切片的完整性及尺寸的大小，而應(yīng)在同一個(gè)切面上多次切削，力求得到厚度較薄的切片。切片時(shí)，切削角盡可能小，以能從試塊上切出薄片為宜(圖1)。由于切片較小，為便于裝片，3 個(gè)切面上的切片應(yīng)分別放置在盛有水的培養(yǎng)皿中，盛水的目的是使切片能自由展開，便于后期裝片。因橫切面上主要觀察管孔式、管孔的組合方式、管孔的內(nèi)含物、軸向薄壁組織類型等特征，對(duì)切片厚度的要求相對(duì)要低，容宜切制；弦切面主要由于木射線是木材中的橫向排列的組織，切片時(shí)的切削阻力主要受厚壁細(xì)胞的影響，因而受力較為均勻；徑切面上則由于薄壁組織與厚壁組織交替出現(xiàn)，切削阻力不斷變化，從而影響切片質(zhì)量，但徑切面切片提供的射線組織類型等信息，是進(jìn)口闊葉樹木材識(shí)別的非常重要的依據(jù)，因而對(duì)徒手切片提出了更高的要求。

徒手切片法得到的切片尺寸較小，為全面反映木材的微觀構(gòu)造特征，裝片時(shí)應(yīng)在同一載玻片上盡可能多的裝載切片。為便于觀察，客觀的記載木材的微觀特征，盡可能挑選厚度較薄、面積較大的樣品，每一載玻片上只裝來自于同一切面的切片，每一切面一般裝2～3個(gè)臨時(shí)切片，縱切面切片裝片前需用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、70%、85%、95%及100%的酒精進(jìn)行逐級(jí)脫水，橫切面切片則可直接裝片，但應(yīng)排除殘留在蓋玻片內(nèi)的氣泡。兩者均依靠毛細(xì)管力使切片固定，應(yīng)即裝即觀察，以免切片因干燥應(yīng)力卷曲使蓋玻片拱起而前功盡棄。

觀察時(shí)應(yīng)本著逐面進(jìn)行、化零為整、多切片多視野觀察、同切面不同切片相互補(bǔ)充和佐證的原則，并對(duì)所觀察的特征進(jìn)行詳細(xì)記載，然后查閱相關(guān)資料進(jìn)行檢索。對(duì)于疑似木種的某些在切片上未表現(xiàn)或表現(xiàn)不明顯的特征，可以有針對(duì)性的重新切片和觀察，如此循環(huán)，直致得出最后結(jié)論，將鑒定的原始紀(jì)錄及試樣編號(hào)并妥善保存，以備質(zhì)疑復(fù)檢。2

快速徒手切片法觀察谷子和水稻葉片顯微結(jié)構(gòu)研究背景水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是僅次于玉米和小麥的世界第三大糧食作物，是單子葉植物、 特別是禾本科作物進(jìn)行生物學(xué)研究的模式植物，其主要原因是水稻的基因組較小和重復(fù)序列少。水稻的全基因組序列已知，并已經(jīng)構(gòu)建成高密度的物理圖譜和遺傳圖譜，有助于對(duì)水稻基因功能的研究。谷子是在我國(guó)種植歷史最為悠久的雜糧作物之一，與玉米、 高粱等其他禾本科作物相比，谷子基因組更小，且隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在 2012 年對(duì)谷子完成了全基因組測(cè)序，基因組大小為 423 Mb，其中 81%的基因已經(jīng)被注釋。又因谷子為C4植物，且與水稻的基因組有高度共線性，對(duì)谷子的功能基因研究勢(shì)必會(huì)成為未來研究的熱點(diǎn)問題之一。從生物學(xué)或是遺傳學(xué)意義而言，突變體是生物體某個(gè)性狀或某個(gè)基因(或染色體)發(fā)生 DNA 的堿基變化的個(gè)體。

對(duì)于突變體庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)成熟，但是用任何一種誘變方法產(chǎn)生的突變體數(shù)量都很多，對(duì)于目的突變體植株的篩選工作量很大，尤其是對(duì)于篩選植物解剖學(xué)方面的突變植株。 對(duì)于解剖學(xué)方面突變體篩選的研究主要集中在泡狀細(xì)胞發(fā)生改變的突變體、維管束數(shù)目間距及維管束間葉肉細(xì)胞數(shù)目發(fā)生變化等的突變體的篩選。主要的方法是進(jìn)行石蠟切片觀察，但是石蠟切片流程長(zhǎng)，耗時(shí)久，且揮發(fā)性有機(jī)試劑利用量大，對(duì)人體有危害。本研究改進(jìn)了徒手切片的方法，增加了透明過程，對(duì)染液進(jìn)行了篩選。該方法可對(duì)突變體材料進(jìn)行預(yù)篩選，對(duì)于突變體的解剖學(xué)篩選過程，從取材到觀察僅需一個(gè)小時(shí)，大大縮短了時(shí)間，且有機(jī)試劑使用量大幅減少，既能減少對(duì)人體危害，又能降低實(shí)驗(yàn)成本。

研究討論徒手切片操作簡(jiǎn)單，與石蠟切片方法相比不需要進(jìn)行固定、脫水、浸蠟、包埋等過程，從而大大縮短實(shí)驗(yàn)操作流程，減少耗時(shí)，且僅在透明和染色過程中需用試劑處理材料，從而降低實(shí)驗(yàn)成本。另外，徒手切片還不需要切片機(jī)等貴重儀器，作為對(duì)于解剖學(xué)突變體的預(yù)篩選過程，可以很大程度上減少工作量，提高篩選速率，降低研究成本。還可以作為對(duì)需要做石蠟切片觀察的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行初選，及對(duì)不需要進(jìn)行精細(xì)觀察組織結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究提供簡(jiǎn)便方法。傳統(tǒng)徒手切片方法為單手利用一片刀片切片，由于水稻和谷子葉片較窄，質(zhì)地較軟，單手切片不易切出理想材料。本方法利用雙手用兩片雙面刀片進(jìn)行切片，材料切片切口整齊，厚薄均一，且避免了切片時(shí)由于來回拉切對(duì)材料造成的損傷。谷子和水稻兩種植物葉片葉綠素含量很高，且相比較于石蠟切片、半薄切片等厚度均厚許多，不進(jìn)行透明操作直接進(jìn)行觀察，或是用酒精脫去葉綠素后觀察均不能看清細(xì)胞邊界，本方法利用水合氯醛的飽和乳酸溶液進(jìn)行透明后得到完整、清晰的觀察結(jié)果。水合氯醛是常用的化學(xué)透明劑之一，它能夠迅速進(jìn)入組織，還可以溶解植物葉綠體、樹脂、蛋白質(zhì)、及細(xì)胞內(nèi)很多種內(nèi)含物，使植物細(xì)胞清晰透明，易于觀察。

經(jīng)過透明后的植物組織需用染色劑進(jìn)行染色，染色后可以使各部位顯示出不同顏色，以便于更加清楚的觀察各組織的結(jié)構(gòu)。不同染液可以使組織不同部位顯示出顏色差異。蘇木精為一種核染料，還可以使植物組織中的纖維素、 質(zhì)體等著色。甲苯胺藍(lán)是一種堿性染料，與不同的組織作用會(huì)產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)：如可以將初生細(xì)胞壁染成紅色，木質(zhì)素可以染成淺綠色，細(xì)胞質(zhì)可以染成紫紅色等，是植物組織染色中應(yīng)用比較普遍的一種染料。本方法經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)相比較于蘇木精染液染色效果更好，觀察更為清晰。

徒手切片技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、 制作快速等優(yōu)點(diǎn)，在很早之前便運(yùn)用于植物學(xué)形態(tài)觀察和教學(xué)中，它能夠觀察新鮮材料組織和細(xì)胞的自然色澤，看到活體細(xì)胞結(jié)構(gòu)狀態(tài)，是石蠟制片之前初選實(shí)驗(yàn)材料常用的簡(jiǎn)易制片方法。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了傳統(tǒng)徒手切片的制作過程，對(duì)徒手切片的流程增加了透明過程，另外對(duì)染液的選擇進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)的染色效果較為理想。另外水稻的成熟葉片也運(yùn)用本方法進(jìn)行了觀察，同樣可觀察到清晰結(jié)構(gòu)，說明本方法不僅可以應(yīng)用于幼嫩材料。對(duì)徒手切片的這些改進(jìn)給科研工作者制備禾本科作物的組織切片提供了簡(jiǎn)易方
法。而且本方法既經(jīng)濟(jì)適用、又簡(jiǎn)單易行，也可運(yùn)用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。3

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

王沛 - 副教授、副研究員 - 中國(guó)科學(xué)院工程熱物理研究所