[科普中國(guó)]-顯微光學(xué)成像

顯微光學(xué)成像，通常也稱(chēng)“光學(xué)顯微成像”，或“光學(xué)顯微術(shù)”（Optical Microscopy，或Light Microscopy），是指透過(guò)樣品或從樣品反射回來(lái)的可見(jiàn)光，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)透鏡后，能夠得到微小樣品的放大圖像的技術(shù)。所得圖像可以通過(guò)目鏡直接用眼睛觀察，也可以用感光板或數(shù)字化圖像探測(cè)器如CCD、CMOS進(jìn)行記錄，還可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行顯示和分析處理。

1.簡(jiǎn)介顯微光學(xué)成像，通常也稱(chēng)“光學(xué)顯微成像”，或“光學(xué)顯微術(shù)”（Optical Microscopy，或Light Microscopy），是指透過(guò)樣品或從樣品反射回來(lái)的可見(jiàn)光，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)透鏡后，能夠得到微小樣品的放大圖像的技術(shù)。所得圖像可以通過(guò)目鏡直接用眼睛觀察，也可以用感光板或數(shù)字化圖像探測(cè)器如CCD、CMOS進(jìn)行記錄，還可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行顯示和分析處理。

采用明場(chǎng)照明方式的普通光學(xué)顯微術(shù)通常存在三個(gè)方面的局限性：一是只能對(duì)深色樣品（透射型）或強(qiáng)反光樣品（反射型）進(jìn)行成像；二是光學(xué)衍射極限限制了該技術(shù)的最高分辨率約為200 nm；三是離焦信息會(huì)降低圖像對(duì)比度?；跇悠分校ㄍ庠椿騼?nèi)源）熒光分子的激發(fā)和熒光發(fā)射的熒光顯微術(shù)（Fluorescence Microscopy），可以突破無(wú)法對(duì)透明樣品成像的局限，但分辨率受限和離焦干擾的問(wèn)題仍需要采取其他措施才能加以解決。

2 無(wú)色透明樣品的顯微光學(xué)成像對(duì)于無(wú)色透明樣品，例如未經(jīng)任何處理的活細(xì)胞，采用普通的光學(xué)顯微術(shù)一般會(huì)由于缺乏足夠的對(duì)比度而無(wú)法直接觀察和成像，原因是這些樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)并不會(huì)導(dǎo)致照明光強(qiáng)的吸收，從而不能形成有效的圖像襯度。通常的做法是利用一些特異性染料來(lái)標(biāo)記樣品中的不同結(jié)構(gòu)以提高圖像對(duì)比度，但是染色過(guò)程往往會(huì)改變甚至破壞樣品，從而難以得到樣品本身的真實(shí)信息。然而，采用一些改進(jìn)的技術(shù)，可以使該局限性得到一定程度的改善。這種技術(shù)大致可分成兩類(lèi)，一類(lèi)是通過(guò)改變照明方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，另一類(lèi)則是通過(guò)將樣品對(duì)照明光相位的改變量轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈴?qiáng)分布來(lái)實(shí)現(xiàn)，后者通常稱(chēng)為“相襯法”。

一、照明方式：1.明場(chǎng)照明：

明場(chǎng)照明是光學(xué)顯微術(shù)中最簡(jiǎn)單的一種方式。在倒置顯微鏡中，只需采用白光從樣品下方照射，在樣品上方觀察透射光即可，圖像對(duì)比度取決于樣品不同部位對(duì)光的吸收。采用這種方式最大的缺點(diǎn)是大多數(shù)生物樣品的對(duì)比度都很低，并且會(huì)由于離焦信息的干擾導(dǎo)致分辨率也較低。但優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品也無(wú)需進(jìn)行繁瑣的處理。

2.斜照明：

相比明場(chǎng)照明，斜照明方式的優(yōu)點(diǎn)是能夠使樣品的圖像產(chǎn)生一種三維（3D）的效果，從而凸顯出樣品中一些原本看不到的結(jié)構(gòu)。目前常用的“霍爾曼調(diào)制對(duì)比度”技術(shù)就是基于斜照明方式發(fā)展起來(lái)的，一般用在細(xì)胞培養(yǎng)室中使用的倒置顯微鏡上。但采用斜照明方式并不能顯著提高對(duì)比度和分辨率。

3.暗場(chǎng)照明：

采用暗場(chǎng)照明方式的暗場(chǎng)顯微術(shù)通過(guò)采集樣品散射的光線來(lái)提高無(wú)色透明樣品的圖像對(duì)比度。為了只收集樣品的散射光，暗場(chǎng)照明方式需要采用準(zhǔn)直光源使進(jìn)入像平面的透射光（未散射的部分）強(qiáng)度降到最低。相比另外兩種方式，采用這種照明方式的技術(shù)其缺點(diǎn)主要在于光強(qiáng)較弱導(dǎo)致的成像時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

4.萊因伯格照明

萊因伯格照明（Rheinberg Illumination）方式實(shí)際上是暗場(chǎng)照明的一種特殊變體。其主要區(qū)別通過(guò)在聚光器之前插入彩色的透明濾光片，從而可以用顏色來(lái)區(qū)分樣品中不同空間的成分，例如可將有結(jié)構(gòu)的樣品顯示為紅色，而均勻的背景則顯示為藍(lán)色，或者其它不同顏色的組合（效果也會(huì)有所不同）。

5.其它照明方式

如正交偏振光照明，其襯度取決于樣品不同部位對(duì)偏振光的不同旋轉(zhuǎn)程度。

圖1.相同樣品（鏡頭紙）在明場(chǎng)（左）和暗場(chǎng)（右）照明方式下的成像效果比較

二、相襯法：光學(xué)顯微術(shù)對(duì)無(wú)色透明樣品無(wú)法直接成像的原因在于樣品不改變照明光的強(qiáng)度分布，但實(shí)際上這些樣品由于厚度和折射率的差異會(huì)改變照明光場(chǎng)的相位分布，只是由于人眼和探測(cè)器僅對(duì)強(qiáng)度敏感，不能直接記錄相位信息。因此，假如能把照明光場(chǎng)經(jīng)過(guò)樣品后的相位改變量的分布轉(zhuǎn)化成光強(qiáng)分布，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)這種樣品（通常稱(chēng)為“相位”樣品）的成像，這種技術(shù)稱(chēng)為“相襯法”，用于光學(xué)顯微術(shù)中則形成了各種“相襯顯微術(shù)”。

1.澤尼克相襯顯微術(shù)

20世紀(jì)30年代，荷蘭物理學(xué)家澤尼克（Zernike）首次提出了相襯技術(shù)（1953年獲得諾貝爾獎(jiǎng)），其原理是通過(guò)將直射光（即零頻光）的相位改變±90°（即1/4波長(zhǎng)的光程差）并適當(dāng)衰減，從而使直射光和衍射光發(fā)生干涉而使像平面上的復(fù)振幅分布近似正比于物體的相位分布，將“看不見(jiàn)”的相位變化轉(zhuǎn)化為“可見(jiàn)”的強(qiáng)度分布。在具體光路上，澤尼克相襯顯微鏡需要一個(gè)能夠產(chǎn)生錐形照明光的圓環(huán)型聚光器，以及位于物鏡后焦面處的一個(gè)對(duì)應(yīng)于該錐形照明光通過(guò)區(qū)域的相位環(huán)。采用該技術(shù)，可以方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)染色的活細(xì)胞樣品的直接觀察和成像，但其缺點(diǎn)是不適合厚樣品（上述近似關(guān)系不成立）和極微小樣品（光暈現(xiàn)象嚴(yán)重）。

2.微分干涉相襯顯微術(shù)

微分干涉相襯（Differential Interference Contrast, DIC）顯微術(shù)是目前一些較高端的倒置顯微鏡中通常會(huì)配備的另一種相襯技術(shù)，但相比基于澤尼克法，這種技術(shù)實(shí)現(xiàn)起來(lái)要相對(duì)復(fù)雜一些，也更昂貴一些。在DIC系統(tǒng)中，需采用兩個(gè)特殊棱鏡，稱(chēng)為渥拉斯頓棱鏡，其中一個(gè)裝在聚光器內(nèi)，作用是將照明光分成彼此錯(cuò)開(kāi)的尋常光和非尋常光，并使其光程差小于物鏡的最高分辨率；另一個(gè)裝在物鏡的后焦面處，使經(jīng)過(guò)樣品后的兩束光重新合并成一束并在像面發(fā)生干涉。在樣品中折射率發(fā)生突變的地方，兩束光干涉的結(jié)果會(huì)使圖像產(chǎn)生“浮雕”的立體效果。該技術(shù)要求采用偏振光，因此光路中還包含兩個(gè)偏振器，一個(gè)位于聚光器前（起偏器），另一個(gè)位于物鏡后（檢偏器）。

3.干涉反射顯微術(shù)：

干涉反射顯微術(shù)（Interference Reflection Microscopy）是運(yùn)用干涉原理的另一種相襯顯微術(shù)，也稱(chēng)為“反射干涉相襯（Reflected Interference Contrast, RIC）顯微術(shù)”。RIC主要用于檢測(cè)是否存在粘附，如細(xì)胞是否很好貼壁等。RIC系統(tǒng)和DIC系統(tǒng)的不同之處，除了探測(cè)的是反射光而不是透射光之外，所采用的棱鏡也有所不同。

3 熒光顯微術(shù)利用熒光分子標(biāo)記細(xì)胞樣品中某些特定結(jié)構(gòu)或成分，用波長(zhǎng)較短的光激發(fā)這些熒光分子使其處于高能態(tài)，再對(duì)其退激過(guò)程中所發(fā)射的波長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)的熒光進(jìn)行顯微成像，即為熒光顯微術(shù)。采用該技術(shù)，不僅可以克服普通光學(xué)顯微術(shù)難以直接對(duì)無(wú)色透明的細(xì)胞樣品進(jìn)行成像的缺點(diǎn)，更重要的是還能通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞中特定的結(jié)構(gòu)或者分子、離子實(shí)現(xiàn)“功能成像”。由于離焦干擾等原因，普通寬場(chǎng)熒光顯微術(shù)分辨率并不高，但利用一些特殊技術(shù)可以顯著提高分辨率和對(duì)比度。

1.共聚焦激光掃描顯微術(shù)

共聚焦激光掃描顯微術(shù)（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的基本原理是利用一對(duì)共軛針孔進(jìn)行“空間濾波”，將焦平面以外的雜散光濾除以提高縱向分辨率，實(shí)現(xiàn)非侵入式的“光學(xué)切片”。CLSM的橫向分辨率約為100-200 nm，縱向分辨率可達(dá)500 nm，大大優(yōu)于普通非共焦方式的熒光顯微術(shù)；同時(shí)共焦針孔的應(yīng)用也極大地提高了圖像信噪比。這些優(yōu)點(diǎn)使CLSM被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)的研究，尤其是亞細(xì)胞層次空間結(jié)構(gòu)和功能的研究。

然而CLSM采用的是逐點(diǎn)掃描的成像方式，成像速度受到限制。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微術(shù)（Spinning Disk Confocal Microscopy, SDCM）仍利用CLSM的共焦針孔原理，但由于采用高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤(pán)實(shí)現(xiàn)了非常多焦點(diǎn)的近似面照明，所得熒光可以采用CCD采集，在保持圖像質(zhì)量達(dá)到傳統(tǒng)CLSM水平的同時(shí)成像速度可達(dá)視頻要求，成為活細(xì)胞內(nèi)單分子熒光成像的有力工具。

圖2.共聚焦激光顯微術(shù)（左）和轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微術(shù)（右）原理示意圖

2.全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)

當(dāng)一束光從光密介質(zhì)射向光疏介質(zhì)時(shí)，并且入射角大于臨界角時(shí)，將發(fā)生全內(nèi)反射（Total Internal Reflection, TIR）。由于光的波動(dòng)效應(yīng)，此時(shí)仍會(huì)有少量光能量穿透界面并沿著平行界面的方向傳播，稱(chēng)為隱失波（Evanescent Wave）全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（TIR Fluorescence Microscopy, TIRFM）就是利用這種隱失波來(lái)激發(fā)樣品熒光的，由于其穿透深度一般只有100-200 nm，因而縱向分辨率和圖像信噪比均大大提高。常見(jiàn)的TIRFM有棱鏡型和物鏡型兩類(lèi)。TIRFM一般應(yīng)用于研究細(xì)胞膜或膜內(nèi)附近區(qū)域的動(dòng)態(tài)過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

圖3.棱鏡型（左）和物鏡型（右）全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)示意圖

3.熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）是指兩個(gè)不同熒光分子（或熒光團(tuán)）之間發(fā)生的非輻射能量轉(zhuǎn)移。提供能量與接受能量的熒光分子分別稱(chēng)為供體（Donor）和受體（Acceptor），F(xiàn)RET效應(yīng)強(qiáng)烈依賴(lài)于兩者之間的距離（不超過(guò)10 nm），同時(shí)要求供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有一定重疊，此時(shí)若激發(fā)供體，供體會(huì)通過(guò)FRET效應(yīng)將能量轉(zhuǎn)移給受體，導(dǎo)致供體的熒光強(qiáng)度比其單獨(dú)存在時(shí)要低得多，而受體熒光卻大大增強(qiáng)。利用該效應(yīng)進(jìn)行成像，可實(shí)現(xiàn)非常高的空間分辨率（nm量級(jí)），從而突破光學(xué)衍射極限的限制。利用FRET技術(shù)即可以研究分子之間的相互作用，也可以研究單分子內(nèi)兩亞基之間的結(jié)合或分子構(gòu)象的改變等。在實(shí)際應(yīng)用中，F(xiàn)RET技術(shù)結(jié)合前面提到的SDCM、TIRFM等技術(shù)，可用于活細(xì)胞內(nèi)單分子熒光成像的研究。

圖4. 分子間（上）和分子內(nèi)（下）熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理示意圖

4 超分辨率技術(shù)上述幾種技術(shù)除了FRET可以從物理機(jī)制上突破光學(xué)衍射極限外，其他技術(shù)的分辨率仍然是受其限制的。近十年來(lái)，科學(xué)家們又發(fā)展了多種能夠一定程度上突破該限制的新技術(shù)，統(tǒng)稱(chēng)為“超分辨技術(shù)”，主要有三類(lèi)：結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（Structured Illumination Microscopy, SIM）、受激輻射耗盡顯微術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED）和單分子定位和構(gòu)圖技術(shù)（Single Molecule Localization and Composition），其中單分子定位技術(shù)又包括光激活定位顯微術(shù)（photoactivated localization microscopy, PALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）兩種。采用這些超分辨率技術(shù)之后，成像效果相比傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微術(shù)甚至CLSM和TIRFM等均有顯著提高，目前文獻(xiàn)報(bào)道的橫向分辨率已經(jīng)達(dá)到20-30 nm左右。

圖5.超分辨率顯微術(shù)和傳統(tǒng)高分辨率顯微術(shù)的成像效果比較

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本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

林丹櫻 - 博士 - 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院屈軍樂(lè) - 教授 - 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院