[科普中國(guó)]-保健食品中前花青素的測(cè)定

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了保健食品中前花青素的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于以葡萄籽、葡萄皮、沙棘、玫瑰果、藍(lán)漿果、法國(guó)松樹(shù)皮提取物等為主要原料制造的保健食品中的前花青素的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)限：方法的檢出限（LOD）為1.5×10-4g/100g；方法的定量限（LOQ）為5.0×10-4g/100g。線(xiàn)性范圍為10μg/mL~150μg/mL。

原理前花青素易溶于水，是黃烷-3-苯兒茶酚和表兒茶精連接而成，依據(jù)試樣中前花青素前體或聚合物在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂生成深紅色花青素離子即氰定的原理，使用高效液相色譜，利用C18反向柱分離，在波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，測(cè)定試樣中前花青素含量。

試劑和材料1、甲醇（CH3OH）：分析純

2、甲醇（CH3OH）：色譜純

3、正丁醇(CH3(CH2)2CH2OH)：分析純

4、鹽酸（HCl）：分析純

5、二氯甲烷（CH2Cl2）：分析純

6、異丙醇(CH3)2CHOH）：分析純

7、甲酸（HCOOH）：分析純

8、硫酸鐵銨(NH4Fe(SO4)2·12H2O)：分析純

9、水（H2O）：為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水，電導(dǎo)率（25℃）為0.01mS/m

10、2%硫酸鐵銨(NH4Fe(SO4)2·12H2O溶液：稱(chēng)取硫酸鐵銨2g，用濃度為2mol/L鹽酸溶解，定容至100mL。

11、前花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度≥98%

12、前花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00mg/mL）：稱(chēng)取0.01g前花青素標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.0001g），用色譜純甲醇溶解并定容至10mL，棕色容量瓶中，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

儀器和設(shè)備1、高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器。

2、超聲波清洗器。

3、離心機(jī)：4 000 r/min。

分析步驟1、試樣處理

（1）片劑：取20片試樣，研磨成粉狀。

（2）膠囊：取20粒膠囊內(nèi)容物，混勻。

（3）軟膠囊：擠出20粒膠囊內(nèi)容物，攪拌均勻，如內(nèi)容物含油，應(yīng)將內(nèi)容物盡可能擠完全。

（4）口服液：搖勻后取樣。

2、提取

（1）固體粉狀試樣：根據(jù)試樣含量稱(chēng)取50 mg～500 mg(精確至0.001 g)試樣于50 mI。棕色容量瓶中，加入30 mI分析純甲醇，超聲處理20 min，放冷至室溫后，加分析純甲醇至刻度，搖勻，離心(3 000 r/min，10 min)或放置至澄清后取上清液備用。

（2）含油試樣：根據(jù)試樣含量稱(chēng)取50 mg～500 mg(精確至0.001 g)試樣置于小燒杯中，用5 mI。二氯甲烷使試樣溶解，并倒入50 mI。容量瓶中，再用分析純甲醇多次洗燒杯，并倒入50 mL棕色容量瓶中，用分析純甲醇定容至刻度，搖勻。

（3）口服液：根據(jù)試樣含量準(zhǔn)確吸取1 mI～5 mL樣液，置于50 mL容量瓶中，加分析純甲醇至刻度，搖勻。

3、水解反應(yīng)

將正丁醇與鹽酸按95：5的體積比混合后，取出15 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.5 mI硫酸鐵銨溶液和2 mI試樣溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，待進(jìn)高效液相色譜分析。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.25、0.50、1.0、1.5 mI．置于10 mL棕色容量瓶中，加分析純甲醇至刻度，搖勻。各取2 mL測(cè)定，處理方法同上，以峰高或峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

5、液相色譜參考條件

（1）色譜柱：耐低pH型的ODS C18柱，4.5 mm×150 mm，5μm。

（2）柱溫：35℃。

（3）檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器。

（4）檢測(cè)波長(zhǎng)：525 nm。

（5）流動(dòng)相：水+甲醇(色譜級(jí))+異丙醇+甲酸=73+13+6+8。

（6）進(jìn)樣量：10μL。

（7）流速：1.0 mL/min。

（8）色譜分析：取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液注入色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰高或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

6、 注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免陽(yáng)光直射。

結(jié)果計(jì)算試樣中前花青素的含量按式(1)進(jìn)行計(jì)算：

X=X1×V×f/m （1）

式中：

X——-試樣中前花青素的含量，單位為克每千克或克每升(g/kg或g/L)；

X1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上得到的含量，單位為毫克每毫升(mg/mL)；

V——試樣定容體積，單位為毫升(mL)；

f——稀釋倍數(shù)；

m——試樣的質(zhì)量(或體積)，單位為克或毫升(g或mL)。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的10%1。

色譜圖在上述色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1～圖2。