[科普中國(guó)]-產(chǎn)甲烷菌

簡(jiǎn)介

產(chǎn)甲烷菌是一類(lèi)能夠?qū)o(wú)機(jī)或有機(jī)化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的古細(xì)菌。產(chǎn)甲烷菌是重要的環(huán)境微生物，在自然界的碳素循環(huán)中起重要作用。1

1979年，Balch和Wolfe通過(guò)16S rRNA測(cè)序 將產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為3目（甲烷桿菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7屬14種。1993年，Boone將甲烷八疊球菌科上升為一個(gè)目，建立了火熱產(chǎn)甲烷菌目，至此產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為5目10科25屬59種。2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology將產(chǎn)甲烷菌放在寬廣古生菌門(mén)（Euryarchaeota）中，至此產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為3綱，5目，10科，26屬，78種。產(chǎn)甲烷菌屬于古菌域（Archaea），廣域古菌界（Euryarchaeon），寬廣古生菌門(mén)（Euryarchaeota）。人們對(duì)產(chǎn)甲烷菌的認(rèn)識(shí)約有150年的歷史。人們對(duì)產(chǎn)甲烷菌有極大的興趣是在于產(chǎn)甲烷菌對(duì)天然氣的形成，在自然界與水解菌和產(chǎn)酸菌等協(xié)同作用，使有機(jī)物甲烷化，產(chǎn)生有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物能物質(zhì)——甲烷。

分類(lèi)產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格厭氧的微生物，在嚴(yán)格厭氧技術(shù)發(fā)明之前，產(chǎn)甲烷菌的分離培養(yǎng)研究進(jìn)展緩慢。巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)和甲酸甲烷桿菌(Methanobacterium formicium)是最早分離出的產(chǎn)甲烷菌微生物；1950 年 Hungate 厭氧分離技術(shù)的使產(chǎn)甲烷菌的研究得到迅速的發(fā)展。1974年《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第八版以產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)作為分類(lèi)依據(jù)，將其描述為一個(gè)獨(dú)立的科。2第九版《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中產(chǎn)甲烷菌的分類(lèi)以系統(tǒng)發(fā)育的方法劃分，包括 5 個(gè)大目：甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷 八 疊 球 菌 目(Methanosarcinales)、甲 烷 微 菌 目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)(Liu and Whitman, 2008; 陳森林, 2010)，每個(gè)目的產(chǎn)甲烷菌包含多個(gè)科屬，現(xiàn)已命名的 10 科、31 屬分屬上述5個(gè)目的產(chǎn)甲烷菌。3

近年來(lái)，隨著厭氧分離技術(shù)的改進(jìn)，結(jié)合先進(jìn)的鑒定手段和分析方法，更多種類(lèi)的產(chǎn)甲烷菌菌株被鑒定出來(lái)。在分類(lèi)學(xué)上，產(chǎn)甲烷菌被分別描述為甲烷桿菌綱(Methanobacteria)、甲烷球菌綱(Methanococci)、甲烷微菌綱(Methanomicrobia)和甲烷火菌綱(Methanopyri)，這4 個(gè)綱包括 7 目、14 科、35 屬。其中甲烷微菌綱(Methanomicrobia)有 4目、9科、25屬，是研究最多的產(chǎn)甲烷微生物類(lèi)群。4

甲烷生成途徑研究甲烷的生物合成有 3 種途徑，包括以乙酸為底物，以 H2/CO2 為底物，以甲基類(lèi)化合物為底物的生物合成過(guò)程。研究表明，以乙酸鹽為底物產(chǎn)生的甲烷占自然界甲烷量的 67%，而以 H2/CO2轉(zhuǎn)化形成的甲烷不足自然界甲烷量的33%。很多獨(dú)特的酶類(lèi)參與甲烷生成過(guò)程，這些酶類(lèi)主要有氫化酶、輔酶F420、甲酰甲基呋喃、甲酰四氫甲基喋呤、輔酶 M 等，通過(guò)監(jiān)測(cè)產(chǎn)甲烷過(guò)程中的獨(dú)特酶類(lèi)，可以從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)產(chǎn)甲烷菌的代謝規(guī)律。三種甲烷合成途徑最終都形成甲基輔酶 M，甲基輔酶 M 在甲基輔酶 M 還原酶Ⅰ (MCR Ⅰ)和甲基輔酶 M 還原酶Ⅱ (MCR Ⅱ)的催化下最終形成甲烷。4

細(xì)胞結(jié)構(gòu)

產(chǎn)甲烷菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞封套（包括細(xì)胞壁、表面層、鞘和莢膜）、細(xì)胞質(zhì)膜、原生質(zhì)和核質(zhì)。

產(chǎn)甲烷菌有革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分有所不同。也是與真細(xì)菌的區(qū)別點(diǎn)。

細(xì)胞封套有四種：

1.大多數(shù)G+產(chǎn)甲烷菌的細(xì)胞壁在結(jié)構(gòu)上與G+真細(xì)菌相似，細(xì)胞壁有一層和三層的，單層的厚度為10～20nm，如甲烷桿菌屬與甲烷短桿菌屬。巴氏甲烷八疊球菌的細(xì)胞壁只有一層，厚約200nm。它們化學(xué)成分與G+真細(xì)菌的不同，不含細(xì)胞壁（即不含二胺基庚二酸或細(xì)胞酸）而是假細(xì)胞壁質(zhì)或是未硫酸化的異多糖。三層的細(xì)胞壁壁厚為20～30nm，有內(nèi)層、中層和外層。外層在細(xì)胞分裂橫隔形成時(shí)消失，如瘤胃甲烷短桿菌。

2.G+的熾熱高溫甲烷菌的細(xì)胞壁外有一層六角形的蛋白質(zhì)亞基即S層覆蓋。

3.G-產(chǎn)甲烷菌不具有球囊多聚物或外膜。只有一層六角形或四角形的，由蛋白質(zhì)亞基或糖蛋白亞基組成的S層。

4.甲烷螺菌的細(xì)胞質(zhì)膜外只有一層由蛋白纖維組成的鞘包裹幾個(gè)細(xì)胞。其厚度為10nm。

生理特性1.營(yíng)養(yǎng)特性：甲烷細(xì)菌的能源和碳源物質(zhì)主要有5種，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。

2.特殊輔酶：F420：是黃素單核甘酸的類(lèi)似物，分子量為630的低分子量熒光化合物。它是甲烷細(xì)菌持有的輔酶，在形成甲烷過(guò)程中起著重要作用。

其特點(diǎn)：(1)當(dāng)用420nm波長(zhǎng)的紫光照射時(shí)，能產(chǎn)生自發(fā)藍(lán)綠熒光，這一現(xiàn)象可借以鑒定甲烷細(xì)菌的存在。（2）中性或堿性條件下易被好氧光解，并使酶失活。

CoM:2-巰基乙烷磺酸.

其特點(diǎn)：（1）它是甲烷細(xì)菌獨(dú)有的輔酶，可借以鑒定甲烷細(xì)菌的存在。（2）它在甲烷形成過(guò)程中，起著轉(zhuǎn)移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效應(yīng).。即促進(jìn)CO2還原為CH4的效應(yīng)。

3.環(huán)境條件：氧化還原電位：參與中溫消化的甲烷細(xì)菌要求環(huán)境中應(yīng)維持的氧化還原電位應(yīng)低于一350mV；對(duì)參與高溫消化的甲烷細(xì)菌則應(yīng)低于-500~-600mV。

溫度：低溫菌的適應(yīng)范圍為20~25°C，中溫菌為30~45°C，高溫菌為45~75°C。

pH：大多數(shù)中溫甲烷細(xì)菌的最適pH值范圍約在6.8~7.2之間。

毒物：凡對(duì)厭氧處理過(guò)程起抑制或毒害作用的物質(zhì)，都可稱(chēng)為毒物。

培養(yǎng)方法產(chǎn)甲烷菌是專(zhuān)性厭氧菌，它分離和培養(yǎng)等的操作均需要在特殊環(huán)境和用特殊的技術(shù)進(jìn)行。

培養(yǎng)方法分類(lèi)一般要求不高的可用在液面加石蠟或液體石蠟的液體深層培養(yǎng)法、抽真空的培養(yǎng)法、在封閉培養(yǎng)管中放入焦性沒(méi)食子酸和碳酸鉀除去氧的培養(yǎng)方法（Berker）、Hungate的厭氧滾管法、Hungate的厭氧液體培養(yǎng)法、Balch的厭氧液體培養(yǎng)增壓法等。

具體方法介紹目前最好的是厭氧手套箱，它由四部分組成：

1.附有手套的密閉透明薄膜箱

2.附有兩個(gè)可開(kāi)啟的可抽真空的金屬空氣隔離箱

3.真空泵

4.氫和高純氮的供應(yīng)系統(tǒng)

利用厭氧手套箱可做許多工作，如：分裝厭氧培養(yǎng)基，倒制平板，離心厭氧微生物收集菌體，對(duì)氧敏感的酶和輔酶的分離純化，進(jìn)行電泳、厭氧性生物化學(xué)反應(yīng)和遺傳學(xué)研究等。