[科普中國]-固氮酶

固氮酶是一種能夠?qū)⒌肿舆€原成氨的酶。固氮酶是由兩種蛋白質(zhì)組成的：一種含有鐵，叫做鐵蛋白，另一種含鐵和鉬mo3+，稱為鉬鐵蛋白。鉬鐵蛋白中含有7個(gè)鐵，9個(gè)硫，1個(gè)鉬，1個(gè)中心碳。

基本信息1960年 ,人們獲得了無細(xì)胞的固氮酶提取液1 ,在此基礎(chǔ)上 , Carnahan和 Mortenson等成功地實(shí)現(xiàn)了體外固氮 。 Bullen和 LeComte進(jìn)一步分離出固氮酶的兩個(gè)組分鉬鐵蛋白 (MoFe蛋白 )和鐵蛋白 (Fe蛋白 )。這兩種蛋白單獨(dú)存在時(shí) ,都無固氮酶活性 ,只有二者整合在一起 ,形成復(fù)合體后 ,才具有固氮酶活性 (因?yàn)檫@兩種物質(zhì)作為電子載體能夠起到傳遞電子的作用）。 生物固氮原理簡(jiǎn)介 ：生物固氮是固氮微生物特有的一種生理功能，這種功能是在固氮酶的催化作用下進(jìn)行的。 固氮微生物需氧，而固氮必須是在嚴(yán)格的厭氧微環(huán)境中進(jìn)行。組成固氮酶的兩種蛋白質(zhì)，鉬鐵蛋白和鐵蛋白，對(duì)氧極端敏感，一旦遇氧就很快導(dǎo)致固氮酶的失活，而多數(shù)的固氮菌都是好氧菌，它們要利用氧氣進(jìn)行呼吸和產(chǎn)生能量。

固氮酶結(jié)構(gòu)Fe蛋白Fe蛋白由 nifH基因編碼 。對(duì)多種生物固氮酶鐵蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果表明 , Fe蛋白都不含色氨酸 ,酸性氨基酸的含量均高于堿性氨基酸 ,各屬種間的同源性為 45% ～ 90%,說明鐵蛋白的基本結(jié)構(gòu)較為保守 。

Fe蛋白是兩個(gè)相同的亞基組成的 γ2型二聚體 。二聚體的分子量約為 59 ～ 73kD(因菌種不同而差異 ),每個(gè)亞基的分子量約 30kD。 兩個(gè)亞基通過一個(gè) [ 4Fe-4S]金屬簇橋連 ,每個(gè)亞基的核心是一個(gè)由 8個(gè) β折疊片形成的平面 ,側(cè)面與 9條 α螺旋相連。在二聚體兩個(gè)亞基的界面之間還存在大量的氫鍵和靜電作用 。這些作用力很強(qiáng) ,即使 [ 4Fe-4S]簇被抽提 ,鐵蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)仍能保持。

在 Fe蛋 白 上 有 3 種功 能 位 點(diǎn) :[ 4Fe-4S] 簇 、MgATP結(jié)合 -水解位點(diǎn) 、ADP-R位點(diǎn) 。 前二者密切結(jié)合 ,關(guān)系到電子的傳遞 。有的固氮生物 (如巴西固氮螺菌 )的 Fe蛋白還含有 ADP-R位點(diǎn) (ADP-核糖基化位點(diǎn) ),參與固氮酶活性的調(diào)節(jié) 。在氨存在的情況下 ,由ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶催化鐵蛋白的 ADP-核糖基化 ,抑制固氮酶活性 ;相反 , ADP-核糖糖基水解酶除去 ADP-核糖 ,解除對(duì)固氮酶的抑制 。

在固氮反應(yīng)中 , [ 4Fe-4S] 簇改變氧還電勢(shì)作為分子間電子傳遞的驅(qū)動(dòng)力。反應(yīng)首先由 Na2S2O4 、鐵氧還蛋白 、黃素氧還蛋白 等電子供體提 供電子將 [ 4Fe-4S]2 +還原為 [ 4Fe-4S]1 +, [ 4Fe-4S]1 +再將電子傳遞給鉬鐵蛋白后 , [ 4Fe-4S]1 +再轉(zhuǎn)化為 [ 4Fe-4S]2 +。 傳遞一個(gè)電子要水解 2個(gè) MgATP。

除了作為鉬鐵蛋白的專一性的電子供體外 , 鐵蛋白還具有以下功能 :參與鉬鐵蛋白 M-簇 (FeMoco)的生物合成 ,以及合成的 FeMoco插入鉬鐵蛋白的過程,并且可能對(duì)固氮酶體系的表達(dá)具有調(diào)控功能。

MoFe蛋白Kennedy等人通過 SDS-PAGE法 ,發(fā)現(xiàn)鉬鐵蛋白含有兩種亞基 , 已經(jīng)確定其為異四聚體 (α2 β 2 ),分子量約 220k～ 240kD之間 (因不同來源而異 )。α亞基分子量為 55kD,由 nifD基因編碼 , 大小約為 500個(gè)氨基酸 ,氨基酸序列的同源性在 47% ～ 66%,具有相當(dāng)高的保守性。

在已知的 α亞基氨基酸序列中 ,有 5個(gè) Cys殘基 (Cys62、Cys88、Cys154、Cys183、Cys275)是絕對(duì)保守的 ,可能和鉬鐵蛋白中金屬原子簇的生物合成有關(guān)。 nifK基因編碼的 β亞基分子量為 60kD, 氨基酸序列與 α亞基比較相似 。 α亞基和 β 亞基之間存在廣泛的相互作用 , 它們構(gòu)成一個(gè)近似軸對(duì)稱的 αβ, 兩個(gè)αβ 二聚體以近似軸對(duì)稱的方式交聯(lián)起來 , 形成了 α2β 2四聚體 。

在鉬鐵蛋白中含有 M-簇和 P-簇兩種金屬原子簇 。P-簇是一類獨(dú)特的 [ 8Fe-7S]的原子簇 , 位于 α和 β 亞基二聚體的界面上 。它能夠進(jìn)行多種氧化還原態(tài)的變化, PN經(jīng) 過 不 同 程度 的 氧 化 為 P1 +、 P2 +、 P3 +及PSUPEROX。這些不同氧化態(tài)的 P-簇都具有獨(dú)特的電子順磁共振譜 (EPR)特征 , 為研究 P-簇的功能提供了有效的途徑 。目前認(rèn)為 P-簇是固氮酶反應(yīng)中電子傳遞的中間體 ,負(fù)責(zé)接受和儲(chǔ)存來自鐵蛋白的 [ 4Fe-4S]簇的電子并將電子傳遞到 M-簇 。 M-簇位于鉬鐵蛋白的 α亞基內(nèi) , 僅通過 αCys275和 αHis472兩個(gè)氨基酸殘基與蛋白主鏈相連。它由一個(gè) [ 4Fe-3S]簇和一個(gè) [ 1Mo-3Fe-3S]簇通過 3個(gè) S原子與二者中的 Fe連接而成的Mo1Fe7 S9原子簇 。 FeMoco上連有一個(gè)高檸檬酸分子 ,高檸檬酸分子通過 2個(gè) O原子與 Mo連接 。 MoFe蛋白分辨率 1.16 的 X-射線晶體衍射顯示 , FeMoco內(nèi)還存在一個(gè)輕的原子 , 它以 6個(gè)等同的鍵連接在 [ 4Fe-3S]簇和 [ 1Mo-3Fe-3S]簇的 3個(gè) Fe原子 ,這個(gè)輕的原子可能是 N。

MoFe蛋白在固氮酶催化氮?dú)獾鹊孜镞^程中起催化 、絡(luò)合作用 。鐵蛋白中的 [ 4Fe-4S]簇將電子傳遞給MoFe蛋白的 P-簇 ,使其還原 , 然后 P-簇再將電子傳遞給 FeMoco,底物在此接受電子后被還原 ?？梢?, FeMoco是固氮酶的活性中心 , FeMoco的結(jié)構(gòu)以及其周圍多肽環(huán)境的變化對(duì)固氮酶活性的影響是當(dāng)前研究固氮催化機(jī)制的最活躍領(lǐng)域之一 。

防氧保護(hù)機(jī)制固氮菌在進(jìn)化過程中，發(fā)展出多種機(jī)制來解決既需氧又防止氧對(duì)固氮酶的操作損傷的矛盾。

1、固氮菌以較強(qiáng)的呼吸作用迅速地將周圍互不干涉中的氧消耗掉，使細(xì)胞周圍處于低氧狀態(tài)，保護(hù)固氮酶不受損傷。

2、在根瘤菌中，以豆血紅蛋白與氧氣結(jié)合的方式使豆血紅蛋白周圍的氧氣維持在一個(gè)極低的水平。

3、有些固氮菌能形成一個(gè)阻止氧氣通過的粘液層。

反應(yīng)總式固氮的過程中每個(gè)電子的傳遞需要消耗2~3個(gè)ATP，而且一般固氮生物在固氮的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生氫氣，因此固氮的總反應(yīng)式可寫為：

N2 + 8 H+ + 8 e- ---------> 2NH3 + H2

此過程消耗16~24個(gè)ATP。

固氮酶的多樣性在 Bishop等發(fā)現(xiàn)第二套固氮系統(tǒng)以前 , 人們一直認(rèn)為 ,鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成的固氮酶系統(tǒng)是固氮生物中起固氮作用的唯一系統(tǒng) 。 Bishop在對(duì)棕色固氮菌的研究中 ,發(fā)現(xiàn)存在另外一種固氮酶系統(tǒng) , 使生物體在缺乏 Mo的條件下可以固氮生長(zhǎng) 。這種含釩固氮酶只在無 Mo而有 V的條件下表達(dá) ,由 VFe蛋白和 Fe蛋白 -2組成 ,被認(rèn)為是一種 “備份 ”的固氮酶系統(tǒng)。 Fe蛋白 -2由 vnfH編碼 ,分子量為 64kD,結(jié)構(gòu)和功能均與含鉬固 氮酶的 鐵蛋 白類 似 ;二 者之 間的 同源 性達(dá)90%。釩鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特性和鉬鐵蛋白相似 ,但除 α2β 2外 ,還含有一個(gè)小的 δ亞基 , 組成 α2 β2 δ2六聚體 。VFe蛋白含有一個(gè)與 FeMoco類似的FeVco活性中心和一個(gè)與 MoFe蛋白中具有相似波譜特性的 P-簇 。在催化氮還原的過程中 ,與含鉬固氮酶相比較 , 含釩固氮酶的催化過程釋放更多的 H2, 消耗更多的 MgATP。但是 ,含釩固氮酶在低溫條件下比含鉬固氮酶更具有活性 ,從而在進(jìn)化過程中得以保存 。

第三套固氮酶系統(tǒng)是鐵鐵固氮酶 , 其固氮活性極低 ,由 FeFe蛋白和 Fe蛋白 -3組成 。 Fe蛋白 -3與含鉬固氮酶系統(tǒng)中的 Fe蛋白的氨基酸序列同源性只有60%;FeFe蛋白與 VFe蛋白在 α和 β 的氨基酸序列同源性為 55%,與 MoFe蛋白的同源性只有 32%。這三套固氮酶分別由 nif、vnf及其 anf基因簇調(diào)控 ,它們的固氮能力表現(xiàn)為含 Mo酶 >含 V酶 >僅含F(xiàn)e。1

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

張磊 - 副教授 - 重慶師范大學(xué)