[科普中國(guó)]-生物固氮

生物固氮是指固氮微生物將大氣中的氮?dú)膺€原成氨的過程，固氮生物都屬于個(gè)體微小的原核生物，所以，固氮生物又叫做固氮微生物。

根據(jù)固氮微生物的固氮特點(diǎn)以及與植物的關(guān)系，可以將它們分為自生固氮微生物、共生固氮微生物和聯(lián)合固氮微生物三類。

簡(jiǎn)介生物固氮是根際生物對(duì)話的典型例證之一。自然界中的氮素資源十分豐富，大氣中近80%的氣體為氮素。但只有少數(shù)原核生物，即細(xì)菌和藍(lán)綠藻（藍(lán)藻細(xì)菌）能夠固定空氣中的氮素。這些原核生物通過自生或與植物共生，將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成能被植物吸收利用的氮素，稱為生物固氮。其他的原核生物和真核生物均不能利用大氣中的氮素。與工業(yè)固氮的高溫高壓條件相比，生物固氮在常溫常壓下就可以進(jìn)行，是生物圈中氮循環(huán)的主要氮源之一，所固定的氮素在自然界中相當(dāng)客觀1。

分類生物固氮是指固氮微生物將大氣中的氮還原成氨的過程?？梢苑譃楣采痰⑸锖妥陨痰⑸飪纱箢悺?/p>

共生固氮微生物的特點(diǎn)是與一些綠色植物互利共生，如根瘤菌。它在土壤中分布廣泛，呈棒形、“T”形或“Y”形，只有侵人到豆科植物的根內(nèi)才能完成固氮作用，具有一定的專一性，某種特定的根瘤菌只能侵入某種特定的豆科植物(大豆根瘤菌只能侵入大豆的根，蠶豆根瘤菌可能侵入蠶豆、菜豆和豇豆)。它們與豆科植物的共生關(guān)系表現(xiàn)為：豆科植物通過光合作用制造的有機(jī)物，一部分提供給根瘤菌，根瘤菌通過固氮作用制造的氨則提供給豆科植物。其代謝類型為異養(yǎng)需氧型，而且固氮量較大。

自生固氮微生物的特點(diǎn)是在土壤中能夠獨(dú)立進(jìn)行固氮的微生物，如圓褐固氮菌。它呈桿狀或球狀，它具有較強(qiáng)的固氮能力，并且能夠分泌生長(zhǎng)素，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育。其代謝類型為異養(yǎng)需氧型，其固氮量較小2。

固氮形式聯(lián)合固氮有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等。能夠生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等植物根內(nèi)的皮層細(xì)胞之間。這些固氮微生物和共生的植物之間具有一定的專一性，但是不形成根瘤那樣的特殊結(jié)構(gòu)。這些微生物還能夠自行固氮，它們的固氮特點(diǎn)介于自生固氮和共生固氮之間，這種固氮形式叫做聯(lián)合固氮。

微生物在自然界中，有很多原核微生物，包括細(xì)菌和放線菌，它們可以在特定條件下把氮?dú)膺€原為氨，因而被稱為固氮微生物。固氮微生物的固氮過程完全是生物和微生物自發(fā)進(jìn)行的，無(wú)須提供任何能源和設(shè)備，因而它減少了能源的消耗。由于全部固氮過程都是生物活動(dòng)，無(wú)污染物排放，有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。同時(shí)，由于減少和免除了化學(xué)氮素的投入，使農(nóng)產(chǎn)品中硝酸和亞硝酸物質(zhì)大幅度降低，提高了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，減少致癌物質(zhì)對(duì)人類的危害。

固氮菌原核微生物，屬于自生固氮菌，其代謝類型是異養(yǎng)需氧型。利用的是土壤中的腐殖質(zhì)，故在生態(tài)系統(tǒng)中的成分是分解者。

自生固氮微生物是指在土壤中能夠獨(dú)立進(jìn)行固氮的微生物，其中，多數(shù)是一類叫做自生固氮菌的細(xì)菌。自生固氮菌大多是桿菌或短桿菌，單生或?qū)ι?。?jīng)過兩三天的培養(yǎng)，成對(duì)的菌體呈“8”字形排列，并且外面有一層厚厚的莢膜。自生固氮菌中，人們應(yīng)用得最多的是圓褐固氮菌(Azotobocter chroococcum）。圓褐固氮菌具有較強(qiáng)的固氮能力，并且能夠分泌生長(zhǎng)素，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育，因此，將圓褐固氮菌制成菌劑，施用到土壤中，可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。

根瘤菌根瘤菌(root nodule bacteria）是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I(yíng)養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌。這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力。已知全世界豆科植物近兩萬(wàn)種。根瘤菌是通過豆科植物根毛、側(cè)根杈口（如花生）或其他部位侵入，形成侵入線，進(jìn)到根的皮層，刺激宿主皮層細(xì)胞分裂，形成根瘤，根瘤菌從侵入線進(jìn)到根瘤細(xì)胞，繼續(xù)繁殖，根瘤中含有根瘤菌的細(xì)胞群構(gòu)成含菌組織。

氮循環(huán)構(gòu)成氮循環(huán)的主要環(huán)節(jié)是：生物體內(nèi)有機(jī)氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。

植物吸收土壤中的銨鹽和硝酸鹽，進(jìn)而將這些無(wú)機(jī)氮同化成植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等有機(jī)氮。動(dòng)物直接或間接以植物為食物，將植物體內(nèi)的有機(jī)氮同化成動(dòng)物體內(nèi)的有機(jī)氮。這一過程叫做生物體內(nèi)有機(jī)氮的合成。動(dòng)植物的遺體、排出物和殘落物中的有機(jī)氮被微生物分解后形成氨，這一過程叫做氨化作用。在有氧的條件下，土壤中的氨或銨鹽在硝化細(xì)菌的作用下最終氧化成硝酸鹽，這一過程叫做硝化作用。氨化作用和硝化作用產(chǎn)生的無(wú)機(jī)氮，都能被植物吸收利用。在氧氣不足的條件下，土壤中的硝酸鹽被反硝化細(xì)菌等多種微生物還原成亞硝酸鹽，并且進(jìn)一步還原成分子態(tài)氮，分子態(tài)氮?jiǎng)t返回到大氣中，這一過程叫做反硝化作用。

大氣中的分子態(tài)氮被還原成氨，這一過程叫做固氮作用。沒有固氮作用，大氣中的分子態(tài)氮就不能被植物吸收利用。地球上固氮作用的途徑有三種：生物固氮、工業(yè)固氮（用高溫、高壓和化學(xué)催化的方法，將氮轉(zhuǎn)化成氨）和高能固氮（如閃電等高空瞬間放電所產(chǎn)生的高能，可以使空氣中的氮與水中的氫結(jié)合，形成氨和硝酸，氨和硝酸則由雨水帶到地面）。據(jù)科學(xué)家估算，每年生物固氮的總量占地球上固氮總量的90%左右，可見，生物固氮在地球的氮循環(huán)中具有十分重要的作用。

分子氮生物固氮是固氮微生物特有的一種生理功能，這種功能是在固氮酶的催化作用下進(jìn)行的。固氮酶是一種能夠?qū)⒎肿拥€原成氨的酶。固氮酶是由兩種蛋白質(zhì)組成的：一種含有鐵，叫做鐵蛋白，另一種含有鐵和鉬，叫做鉬鐵蛋白。只有鐵蛋白和鉬鐵蛋白同時(shí)存在，固氮酶才具有固氮的作用。生物固氮過程可以用下面的反應(yīng)式概括表示。

N2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-（酶）→2NH3+nMg-ADP+nPi

分析上面的反應(yīng)式可以看出，分子氮的還原過程是在固氮酶的催化作用下進(jìn)行的。有三點(diǎn)需要說明：第一，ATP一定要與鎂（Mg）結(jié)合，形成Mg-ATP復(fù)合物后才能起作用；第二，固氮酶具有底物多樣性的特點(diǎn)，除了能夠催化N2還原成NH3以外，還能催化乙炔還原成乙烯（固氮酶催化乙炔還原成乙烯的化學(xué)反應(yīng)，常被科學(xué)家用來測(cè)定固氮酶的活性）等；第三，生物固氮過程中實(shí)際上還需要黃素氧還蛋白或鐵氧還蛋白參與，這兩種物質(zhì)作為電子載體能夠起到傳遞電子的作用。

鐵蛋白與Mg-ATP結(jié)合以后，被黃素氧還蛋白或鐵氧還蛋白還原，并與鉬鐵蛋白暫時(shí)結(jié)合以傳遞電子。鐵蛋白每傳遞一個(gè)e-給鉬鐵蛋白， 同時(shí)伴隨有兩個(gè)Mg-ATP的水解。在這一催化反應(yīng)中，鐵蛋白反復(fù)氧化和還原，只有這樣，e-和H+才能依次通過鐵蛋白和鉬鐵蛋白，最終傳遞給N2和乙炔，使它們分別還原成NH3和乙烯。

1886年在第59屆德國(guó)科學(xué)家和醫(yī)生學(xué)術(shù)討論會(huì)上，德國(guó)學(xué)者赫爾利格爾(Hermann Hellriegel）首次提出令人驚奇的試驗(yàn)結(jié)果，即當(dāng)大豆生長(zhǎng)在缺氮的土壤中時(shí)，大豆的根瘤也能使其良好生長(zhǎng)，其機(jī)理在于其根瘤具有固氮功能。在當(dāng)時(shí)稱之為根生桿菌，現(xiàn)在稱之為大豆根瘤菌的細(xì)菌對(duì)豆科植物根部的根瘤形成具有特殊的刺激作用。在根瘤菌內(nèi)，根瘤菌將大氣中的氮還原為能被植物吸收利用的氨，豆科宿主在吸收了這些氨之后又能將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹袡C(jī)化合物，以供其生長(zhǎng)發(fā)育之需。通過對(duì)根瘤菌進(jìn)行接種培養(yǎng)后于1895年就獲得了具有很強(qiáng)固氮能力的根瘤菌菌種。通過添加滅菌草木灰等吸附劑之后，大批根瘤菌被施用到三葉草、豌豆和小扁豆等豆科作物的種植地中以提高其產(chǎn)量。

現(xiàn)在已經(jīng)知道，在自然界具有固氮功能的生物種類很多，其中有自養(yǎng)固氮生物和異養(yǎng)固氮生物這兩大類型。在異養(yǎng)固氮生物中因宿主植物的差異而被劃分為豆科植物共生固氮菌和非豆科植物共生固氮菌。盡管固氮生物多種多樣，但在其固氮過程中都需要共同的固氮基因（nif）的參與。在共生固氮生物中固氮體系非常復(fù)雜，除了nif基因在固氮過程中起關(guān)鍵性作用之外，其它基因的協(xié)同作用也非常重要。

由于根瘤菌具有的特殊功能，大批熱心的研究者對(duì)其特征特性，對(duì)寄主的侵染方式、固氮機(jī)制和商業(yè)價(jià)值等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。本世紀(jì)80年代以來，學(xué)者們一方面從分子水平進(jìn)一步研究根瘤菌在豆科植物上的固氮機(jī)理和改造根瘤菌，試圖培育出活性更強(qiáng)的根瘤菌；另一方面利用人工誘導(dǎo)方式誘發(fā)非豆科作物根部結(jié)瘤，試圖利用根瘤菌的特殊功能使非豆科作物也能共生固氮，以便減少農(nóng)田中氮肥的施用量，降低農(nóng)作物的生產(chǎn)成本。除此之外，在70年代末，由于在放線菌中發(fā)現(xiàn)了弗蘭克氏菌（Frankia）與多種非豆科樹木能共生結(jié)瘤并具有固氮效應(yīng)，因而在生物固氮研究中又產(chǎn)生了一個(gè)新的分支，即以研究弗蘭克氏菌的分類、功能、分布和應(yīng)用前景為主要內(nèi)容的新領(lǐng)域。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，與豆科植物的根瘤菌的固氮體系相比，利用弗蘭克氏菌具有廣譜侵染的特性，對(duì)建立新的固氮技術(shù)體系可能具有更大的意義，應(yīng)用前景更廣闊。

研究動(dòng)態(tài)現(xiàn)在已經(jīng)知道，生物固氮作用只限于原核類微生物（細(xì)菌和放線菌）；所有不同種類的固氮微生物都由共同的固氮基因（nif）控制著固氮特性遺傳，nif基因和固氮酶只存在于固氮菌體中；具有共生固氮特性的高等植物僅僅提供宿主條件，以便固氮菌的固氮效能得到充分表達(dá)；通過遺傳操作實(shí)現(xiàn)了nif基因在不同種細(xì)菌之間相互轉(zhuǎn)移，由此對(duì)nif基因的位置、數(shù)目、結(jié)構(gòu)和功能等方面有了更深入的了解。

通過對(duì)自身固氮生物的nif基因進(jìn)行分子生物學(xué)研究知道，在克氏肺炎桿菌Kp中存在著17～18個(gè)nif基因，這些基因都位于其染色體上，其中有固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifKDH、調(diào)節(jié)基因nifAL和固氮酶合成后的加工基因nifB以及其它與電子傳遞相關(guān)的基因。在同一固氮生物的個(gè)體中所有nif基因均連鎖在一起，其中不存在非nif基因的插入成分；在nif基因群中存在著7個(gè)操縱子，其中有6個(gè)操縱子具有向同一方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的功能（Puhler，1984）；在nifF基因和nifH基因之間還存在著一段反向閱讀框架。

已經(jīng)證實(shí)，在根瘤菌中的nif基因和結(jié)瘤基因都被定位在質(zhì)粒上。根瘤菌的質(zhì)粒有多種，其分子量為90×108或140×106或大于300×106。在根瘤菌的質(zhì)粒中除了固氮基因之外還存在著結(jié)瘤基因（nod），使宿主的根毛變形彎曲的基因（hac）、根瘤起始基因（noi）和產(chǎn)生色素的基因（pig）等等。

在宿主植物中也有許多基因參與共生固氮作用，其中豆血紅蛋白基因起著非常重要的作用。在豆科植物的根瘤內(nèi)豆血紅蛋白具有運(yùn)氧功能，由此降低擬菌體周圍的氧分壓，以利于在嫌氣條件下進(jìn)行固氮作用。如果在根瘤內(nèi)不存在著豆血紅蛋白則為無(wú)效根瘤，這種根瘤不具有固氮功能。豆血紅蛋白基因是隱性基因，只有當(dāng)根瘤菌侵入宿主的根毛之后該基因才有可能表達(dá)。除此之外，在根瘤發(fā)育過程中還需要18～20種基因的產(chǎn)物（多肽）協(xié)同作用，這些基因統(tǒng)稱為結(jié)瘤素基因，其多肽產(chǎn)物統(tǒng)稱為結(jié)瘤素。

豆科植物固氮研究的發(fā)展趨勢(shì)主要在兩個(gè)方面，即應(yīng)用研究和基礎(chǔ)理論研究。在應(yīng)用研究方面，試圖培育出具有更強(qiáng)的固氮能力和具有吸氫酶基因的根瘤菌已經(jīng)成為該領(lǐng)域的重要研究方向之一?；魻査固?Holster）等（1970）報(bào)道，根瘤菌可以與豆科植物在體外建立起共生關(guān)系，根瘤菌從細(xì)胞間隙進(jìn)入大豆細(xì)胞內(nèi)，但這種體外共生體系的固氮酶活性比較低，只相當(dāng)于正常大豆根瘤的1%。通過研究工程化根瘤菌，篩選出新的固氮菌和根瘤菌接種劑，使豆科植物的結(jié)瘤數(shù)增加，固氮能力增強(qiáng)。已知固氮作用要消耗植物制造的光合產(chǎn)物的15～30%，在固氮過程中的放氫反應(yīng)實(shí)際上是一種能量浪費(fèi)?，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，在少數(shù)根瘤菌中存在著吸氫酶基因，其產(chǎn)物能回收在固氮作用過程中所放出的氫，由此形成ATP，節(jié)省能量，提高固氫效率。目前對(duì)這種吸氫酶基因已經(jīng)進(jìn)行了定位和克隆，如果能將這種基因轉(zhuǎn)化到不具有吸氫酶基因的大多數(shù)根瘤菌中，則由此培育的新根瘤菌將具有更大的固氮活性和固氮效率。在基礎(chǔ)理論研究方面，需要探明在根瘤菌與豆科植物共生固氮過程中雙方有多少基因參與結(jié)瘤固氮作用，以便為建立人工模擬固氮體系提供理論依據(jù)；闡明根瘤菌對(duì)豆科植物專一性識(shí)別的機(jī)制，以便利用人工方法更精確地打破識(shí)別的專一性，擴(kuò)大宿主范圍；研究根瘤菌侵染宿主根毛之后，誘導(dǎo)宿主根內(nèi)豆血紅蛋白基因和結(jié)瘤素基因表達(dá)的機(jī)理，從而控制固氮根瘤菌的有效性。

非豆科在非豆科植物生物固氮的研究中主要包括兩個(gè)研究方向。其一是采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)路線和切實(shí)可行的研究方法將根瘤菌導(dǎo)入非豆科作物中，在非豆科作物與根瘤菌之間形成共生關(guān)系，由此形成根瘤，擴(kuò)大根瘤菌的宿主范圍和提高其固氮效應(yīng)。其二是采用先進(jìn)的生物技術(shù)進(jìn)一步對(duì)固氮放線菌Frankia的生物學(xué)特性及其應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討，以便挖掘Frankia菌在非豆科植物上的固氮潛力，由此形成生物固氮的新技術(shù)體系。

1.在非豆科植物與根瘤菌之間形成共生關(guān)系的探討

德國(guó)植物學(xué)家拜爾（1888）首次在半寄生性草本植物草山蘿和大豬鼻花（屬于非豆科植物）的根部發(fā)現(xiàn)了根瘤，但這一奇特的現(xiàn)象并沒有引起人們的關(guān)注。特里尼克（Trinick)（1973）首次證實(shí)，豇豆屬植物根系中所存在的根瘤菌能與榆科植物共生結(jié)瘤固氮。帕甘（Pagan）等（1975）在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在沒有宿主植物細(xì)胞的情況下，豇豆根瘤菌能在人工培養(yǎng)基上獨(dú)立生活和自行固氮，否定了長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為根瘤脫離宿主植物就不能固氮的傳統(tǒng)觀念。如今已經(jīng)知道，在殘留的根部形成根瘤的非豆科植物的數(shù)量并不少，僅在俄羅斯的西伯利亞就有75個(gè)物種，分屬于21個(gè)科，其中在進(jìn)化史中最為年青的菊科植物中，其根系形成根瘤是一種最常見的現(xiàn)象。在新幾內(nèi)亞，在榆科的狗兒屎屬植物Parasporiarogosa通常生長(zhǎng)在茶葉樹的行間，在其根部很容易發(fā)現(xiàn)與熱帶豆科植物相類似的結(jié)瘤現(xiàn)象。

在自然條件下植物體與微生物相結(jié)合后形成固氮體系的現(xiàn)象在70年代就已經(jīng)引起了人們的關(guān)注。除了根瘤菌與豆科植物之間的共生固氮關(guān)系之外，還存在著蘭綠藻與植物固氮；微生物與植物葉面結(jié)合固氮；土壤微生物與植物結(jié)合固氮；含脂剛螺菌與高等植物結(jié)合固氮。除此之外，對(duì)固氮稻的研究有了新的進(jìn)展。在稻的根際嫌氣性細(xì)菌和好氣性細(xì)菌呈鑲嵌狀態(tài)，有著保護(hù)氧的作用，故稻的根際是最適于固氮菌存在的地方；現(xiàn)代栽培稻的固氮能力及各品種在固氮能力上所存在的差異是由其遺傳性所支配，旱稻幾乎沒有固氮能力；在稻根際與固氮菌之間存在著松弛的共生關(guān)系。有關(guān)專家預(yù)測(cè)，通過尋找稻根際固氮基因和支配其固氮能力的基因，有可能利用具有更強(qiáng)固氮能力的基因或基因組，通過基因工程培育出固氮稻新品系。在80年代中期，將含有固氮調(diào)控基因nifA的質(zhì)粒pMC78A引進(jìn)到水稻根際固氮菌——催娩克氏菌（klebsiellaoxytocaNG18）中之后，篩選到耐氨菌株。將耐氨固氮菌接種到水稻根系之后，其根際固氮活性提高3～5倍，植株含氮總量提高20～30%，植株干重增加10～20%（日該國(guó)立遺傳學(xué)研究所，1985～1986）。

自從聶延富（1983）利用植物生長(zhǎng)素2，4-D處理根系，誘導(dǎo)根瘤菌侵入小麥根部形成根瘤的試驗(yàn)獲得成功之后，中國(guó)在利用根瘤菌侵染非豆科植物形成根瘤方面開展了多方面的探索性研究，試圖通過人工方法促使非豆科植物與根瘤菌形成共生關(guān)系，以便擴(kuò)大生物固氮的范圍。目前關(guān)于利用2，4-D誘導(dǎo)非豆科作物根系與固氮菌共生結(jié)瘤，國(guó)內(nèi)外已在小麥、油菜、水稻和胡蘿卜等作物上取得了成功。阿勒馬拉（Al-Mallah）等（1989）利用纖維素酶yc、果膠酶Y23和甘露醇的細(xì)胞壁降解酶混合物處理幼苗根系，在有聚乙二醇存在的條件下將根瘤菌接種在水稻根系上，結(jié)果，在水稻根系上結(jié)出了根瘤。自80年代以來，中國(guó)相繼對(duì)水稻、玉米、小麥和高梁等非豆科作物的聯(lián)合結(jié)瘤固氮進(jìn)行了深入的研究，成功地分離出一批具有高效固氮功能的聯(lián)合固氮菌株，如糞產(chǎn)堿菌、稻黃桿菌和固氮螺菌等等。中國(guó)學(xué)者提出的“共生固氮體系中最佳結(jié)瘤固氮控制模型的研究”的探索性項(xiàng)目被列入國(guó)家的“攀登計(jì)劃”。然而，總的來看，作為基礎(chǔ)性研究，國(guó)內(nèi)外在非豆科作物固氮方面雖不斷取得新進(jìn)展，但離農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)長(zhǎng)的一段距離。

2.引導(dǎo)固氮生物侵入非豆科植物的方法

豆科植物的根瘤是一個(gè)非常復(fù)雜的共生體系，根瘤菌與豆科植物根系的相互結(jié)合依賴于特異的遺傳機(jī)制。為了打破根瘤菌與豆科植物根系共生結(jié)瘤固氮的特異性，將豆科植物的共生固氮特性擴(kuò)大到不具有共生固氮特性的非豆科植物中，研究者們從許多途徑進(jìn)行了有益的嘗試，獲得了一些有效方法，其中包括如下6種常用的方法。

第一，利用改造后的豆科植物根瘤菌直接侵染非豆科植物。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建攜帶有特定結(jié)瘤基因的質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)母鼍?，由此獲得發(fā)生質(zhì)粒重組的受體菌，再利用受體菌直接侵染非豆科植物。

第二，利用植物裸露的原生質(zhì)體吸收固氮微生物，以此建立起新的固氮體系。已經(jīng)證實(shí)，裸露的原生質(zhì)體比較容易吸收外源遺傳物質(zhì)，不但豆科植物的原生質(zhì)體具有吸收固氮微生物的功能，而且非豆科植物的原生質(zhì)體也具有吸收固氮微生物的功能。曾經(jīng)利用玉米的原生質(zhì)體吸收棕色固氮菌后，玉米原生質(zhì)體表現(xiàn)出固氮活性，這樣的原生質(zhì)體可以培養(yǎng)成愈傷組織，由此分化出的胚在完全缺氮源的培養(yǎng)基上能夠進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。

第三，通過植物愈傷組織與固氮微生物進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，建立新的共生固氮體系。將豆科根瘤菌分別放入半支蓮、胡蘿卜、矮牽牛和囊龍面花等非豆科植物的愈傷組織中，經(jīng)過聯(lián)合培養(yǎng)后根瘤菌與愈傷組織形成新的共生關(guān)系，表現(xiàn)出固氮活性。

第四，利用酶處理打破根瘤菌侵染根毛的障礙。已知根瘤菌對(duì)宿主根毛區(qū)的侵染表現(xiàn)出很強(qiáng)的專一性，即特定的根瘤菌侵染特定的宿主。在玉米、水稻和小麥等作物上的試驗(yàn)結(jié)果表明，利用纖維素酶和果膠酶處理作物的根部后，其根毛細(xì)胞的細(xì)胞壁會(huì)發(fā)生局部破壞，這有助于根瘤菌的侵染和共生結(jié)瘤。

第五，利用植物激素打破根瘤菌侵染根毛的障礙。通過對(duì)非豆科植物的根系進(jìn)行2，4-D處理后可以誘導(dǎo)豆科根瘤菌侵入其根皮層細(xì)胞內(nèi)，隨后可以形成根瘤菌。然而，更進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，在2，4-D誘導(dǎo)下在非豆科植物根系內(nèi)所形成的根瘤與豆科植物的有效根瘤在結(jié)構(gòu)上和功能上都存在著明顯差異，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

第六，通過豆科植物與非豆科植物的原生質(zhì)體融合后培育出新的固氮植物。在70年代中期將窄葉羽扇豆類菌體的原生質(zhì)體與煙草葉肉原生質(zhì)體融合成功后，獲得了融合體。然而，目前在這方面的研究還有一些技術(shù)問題亟待解決。

3.在非豆科植物與Frankia菌之間形成共生關(guān)系的探討

佩克洛(Peklo)（1910）首次提出從非豆科樹木的根瘤中分離內(nèi)生菌的設(shè)想，但他一直沒有達(dá)到預(yù)期目的。在本世紀(jì)60年代，通過超顯微觀察后證實(shí)，在非豆科樹木根瘤內(nèi)所存在的固氮菌是原核生物，其絲狀體有分枝。貝金（Becking)（1970）將非豆科樹木根瘤內(nèi)所存在的內(nèi)生菌歸屬于原核生物界，厚壁菌門，放線菌綱，放線菌目，弗蘭克氏菌科，弗蘭克氏菌屬。直到70年代末，卡拉哈姆（Callaham）等（1978）在香蕨木植物的根系中找到了共生根瘤并從共生根瘤中首次分離出內(nèi)生放線菌。已經(jīng)證實(shí)，在木麻黃、榿木、胡頹子、沙棘、楊梅、馬桑、懸鉤子、仙女木和赤楊等非豆科根瘤中所存在的內(nèi)生固氮菌屬于弗蘭克氏（Frankia）菌屬的微生物。近年的研究主要集中在對(duì)該菌的特征特性進(jìn)行研究。由此發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)rankia菌宿主范圍比較寬，在非豆科樹木的一些科、屬、種間不僅存在交叉感染現(xiàn)象，而且由同一種樹木的根瘤內(nèi)可以獲得在特征特性上存在著明顯不同的Frankia菌株。Frankia菌是生長(zhǎng)緩慢型微好氣性放線菌，能形成特征性孢子囊，在孢子囊內(nèi)含有通過縱橫分裂所形成的不游動(dòng)孢囊孢子。

在被子植物中能與Ftsnkia菌共生結(jié)瘤固氮的非豆科植物皆為喬木或灌木等木本植物，它們不僅具有強(qiáng)大的固氮能力，而且，通常還具有耐干旱（如沙棘）、耐鹽堿（如木麻黃）、耐酸性（如楊梅）和耐水濕（如赤楊）等特性。據(jù)阿克曼(Akkermans）等人（1984）統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)21屬200種非豆科植物能與Frankia菌共生結(jié)瘤固氮。隨后，黃家彬等（1985）在中國(guó)又發(fā)現(xiàn)20種新記載樹種具有與Frankia菌共生結(jié)瘤固氮的特性。最近，李志真等（1998）在福建省林區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)5種能與Frankia菌共生結(jié)瘤固氮的非豆科樹種。因此，目前已發(fā)現(xiàn)8科25屬225種非豆科植物能與Frankia菌共生結(jié)瘤固氮。

中國(guó)于70年代末期開始研究放線菌結(jié)瘤植物，在資源調(diào)查、內(nèi)生菌分離和Frankia菌的生物學(xué)特征特性等方面做了大量的研究工作。目前中國(guó)已經(jīng)成為國(guó)際上擁有Frankia菌株資源最多的基地之一。除此之外，在利用細(xì)胞融合技術(shù)改進(jìn)Frankia菌的特征特性方面已有新的苗頭，利用鏈霉菌和Frankia菌融合后已經(jīng)成功地構(gòu)建成新型的共生固氮放線菌，它具有雙親本性能，即生長(zhǎng)快、結(jié)瘤固氮活性強(qiáng)。

Frankia菌具有跨越科、屬植物進(jìn)行侵染結(jié)瘤固氮的特性，因而被認(rèn)為是研究擴(kuò)大寄主范圍、結(jié)瘤機(jī)制、固氮基因轉(zhuǎn)移和構(gòu)建新的固氮物種的理想材料。隨著對(duì)Frankia菌的特征特性的不斷認(rèn)識(shí)，人們?cè)噲D將此共生體系的固氮功能由木本植物轉(zhuǎn)到禾本科作物上，以解決農(nóng)田氮肥自給問題，減少農(nóng)作物對(duì)氮素化肥的依賴。隨著研究的不斷深入，人類將進(jìn)一步揭示Frankia菌共生固氮的奧秘，闡明其遺傳機(jī)制。利用生物工程技術(shù)和方法構(gòu)建高效的Frankia工程菌和構(gòu)建新的固氮共生體系將成為今后生物固氮研究領(lǐng)域中的發(fā)展方向和追求目標(biāo)。

展望據(jù)測(cè)算，在大氣中氮素含量為3.9×1015噸；在全球耕地內(nèi)生物固氮量理論上可達(dá)到4400萬(wàn)噸，約相當(dāng)于全世界每年生產(chǎn)的化肥總量；全球林地面積約為4.1億公頃，其固氮總量可達(dá)到4000萬(wàn)噸。由于在氮素化肥生產(chǎn)中伴隨著能源耗費(fèi)和日趨嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，人們逐漸認(rèn)識(shí)到農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)完全依賴化肥終非良策，于是，生物固氮研究日益受到各國(guó)政府的重視。

通過適當(dāng)方式固定大氣中的游離氮素，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槟軈⑴c生物體新陳代謝的氨態(tài)氮是地球上維持生產(chǎn)力的一個(gè)重要的生態(tài)反應(yīng)。從戰(zhàn)略上來考慮，正確的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)政策應(yīng)該是既要增加糧食生產(chǎn)，又不要損害土地的持久生產(chǎn)力，而生物固氮正好能同時(shí)滿足這兩個(gè)目的。應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)建立和完善生物固氮體系已經(jīng)成為解決人類目前所面臨的人口、糧食、能源和環(huán)境等問題的重要技術(shù)措施。

近20年來生物固氮已經(jīng)成為一個(gè)多學(xué)科的綜合性研究項(xiàng)目，分別在分子、細(xì)胞、個(gè)體和生態(tài)等多層次水平上，從微觀到宏觀不斷地展開著探索性研究。從目前的研究現(xiàn)狀來看，試圖通過基因工程將nif基因從豆科植物轉(zhuǎn)移到非豆科農(nóng)作物中難度比較大，在短期內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)，而采用細(xì)胞工程方法將根瘤菌導(dǎo)入非宿主農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)則切實(shí)可行。除此之外，由于Frankia菌具有對(duì)宿主的侵染范圍寬、固氮活性比較強(qiáng)和對(duì)氧氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對(duì)Frankia菌的研究將更為重要，有可能由此會(huì)找到新的突破口。在Frankia菌與農(nóng)作物之間建立起新的共生固氮體系將具有更大的可能性。這項(xiàng)研究已呈現(xiàn)出新的苗頭，值得進(jìn)一步探索。

生物固氮研究已經(jīng)引起越來越多的人的關(guān)注。在這方面的研究今后主要包括基礎(chǔ)理論和應(yīng)用基礎(chǔ)這兩個(gè)方面。在基礎(chǔ)理論研究中主要圍繞著誘發(fā)非豆科作物結(jié)瘤的最佳條件和提高共生固氮效能，其中包括誘導(dǎo)根瘤菌侵入主要農(nóng)作物共生結(jié)瘤的有效方法；提高非豆科農(nóng)作物共生結(jié)瘤固氮的效能；根瘤菌導(dǎo)入非豆科宿主細(xì)胞的途徑、共生部位和共生機(jī)理；采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)措施誘導(dǎo)Frankia菌與主要農(nóng)作物結(jié)瘤固氮；Frankia菌共生結(jié)瘤固氮的機(jī)理等等。在應(yīng)用基礎(chǔ)研究中主要圍繞著培育新的固氮植物，其中包括通過生物技術(shù)改造固氮微生物和現(xiàn)有的農(nóng)作物，使新的固氮菌與新的農(nóng)作物更容易形成共生固氮關(guān)系。可以肯定，生物固氮工程的研究已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)新的歷史階段，擴(kuò)大生物間共生固氮范圍和將豆科植物的固氮能力轉(zhuǎn)移到非豆科植物中的研究已呈現(xiàn)出希望之光。隨著生物固氮研究的不斷深入，將逐步實(shí)現(xiàn)禾本科農(nóng)作物與固氮微生物共生結(jié)瘤固氮的美好愿望。

農(nóng)業(yè)應(yīng)用簡(jiǎn)介生物固氮在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的作用。氮素是農(nóng)作物從土壤中吸收的一種大量元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足夠的氮素以彌補(bǔ)損失，土壤的含氮量就會(huì)下降。土壤可以通過兩條途徑獲得氮素：一條是含氮肥料（包括氮素化肥和各種農(nóng)家肥料）的施用；另一條是生物固氮。

拌種對(duì)豆科作物進(jìn)行根瘤菌拌種，是提高豆科作物產(chǎn)量的一項(xiàng)有效措施。播種前，將豆科作物的種子沾上與該種豆科作物相適應(yīng)的根瘤菌，這顯然有利于該種豆科作物結(jié)瘤固氮。特別是新開墾的農(nóng)田和未種植過豆科作物的土壤中，根瘤菌很少，并且常常不能使豆科作物結(jié)瘤固氮，更需要進(jìn)行根瘤菌拌種。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，在其他條件相同的情況下，經(jīng)過根瘤菌拌種的豆科作物，可以增產(chǎn)10%～20%。

做綠肥用豆科植物做綠肥，例如將田箐、苜?；蜃显朴⒌鹊男迈r植物直接耕埋或堆漚后施用到農(nóng)田中，可以明顯增加土壤中氮的含量?？茖W(xué)家統(tǒng)計(jì)過，如果用新鮮的豆科植物飼養(yǎng)家畜，再將家畜的糞便還田，則既可以使土壤肥沃，又可以獲得更多的糧食和畜產(chǎn)品。

本世紀(jì)初以來全球農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量不斷增長(zhǎng)，在一定程度上依賴于氮素化肥的施用量不斷增加。農(nóng)作物依賴于施用氮素化肥所獲得的增產(chǎn)實(shí)際上是以消耗能源和污染環(huán)境為代價(jià)所取得的。在大氣中氮?dú)夂拷咏?0%，但這種氮?dú)獠⒉荒苤苯訛楦叩戎参镂绽?。人類自從發(fā)現(xiàn)豆科植物與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮現(xiàn)象以來對(duì)生物固氮研究已有112年之久，中國(guó)對(duì)生物的共生固氮現(xiàn)象也進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)62年的探索性研究。然而，關(guān)于生物固氮，特別是非豆科農(nóng)作物的生物固氮，還有許多問題有待于進(jìn)一步研究。目前，生物固氮研究已經(jīng)被列為“國(guó)際生物學(xué)計(jì)劃”中的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容，各國(guó)政府都將其視為重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目。通過適當(dāng)方式將生物固氮機(jī)制引入到非豆科農(nóng)作物中，進(jìn)而建立起非豆科農(nóng)作物固氮新體系，這是農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的研究課題。這不僅引起了農(nóng)業(yè)科學(xué)家的極大興趣，而且也受到了全社會(huì)各階層有識(shí)之士的廣泛關(guān)注。

意義大氣中的氮，必須通過以生物固氮為主的固氮作用，才能被植物吸收利用。動(dòng)物直接或間接地以植物為食物。動(dòng)物體內(nèi)的一部分蛋白質(zhì)在分解過程中產(chǎn)生的尿素等含氮廢物，以及動(dòng)植物遺體中的含氮物質(zhì)，被土壤中的微生物分解后形成氨，氨經(jīng)過土壤中的硝化細(xì)菌的作用，最終轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，硝酸鹽可以被植物吸收利用。在氧氣不足的情況下，土壤中的另一些細(xì)菌可以將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽并最終轉(zhuǎn)化成氮?dú)?，氮?dú)鈩t返回到大氣中。除了生物固氮以外，生產(chǎn)氮素化肥的工廠以及閃電等也可以固氮，但是，同生物固氮相比，它們所固定的氮素?cái)?shù)量很少?？梢姡锕痰谧匀唤绲h(huán)中具有十分重要的作用。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

李少斌 - 副教授 - 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院