CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展歷程，它一出現(xiàn)就掀起了一場基因革命

導(dǎo)語

上期我們主要科普了遺傳與基因。本期，我們主要聊一聊基因編輯技術(shù)，包括基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程、分類、原理以及大家關(guān)注的問題，比如基因編輯技術(shù)的應(yīng)用等。

本期我們邀請了上海巴斯德研究所研究員晁彥杰老師。晁老師在博士期間曾參與過諾獎成果的奠基性實驗，發(fā)表了20余篇高影響力的論文，被引用次數(shù)超過6000次，是這個領(lǐng)域的“學(xué)術(shù)新星”。

01 基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程

葉水送：基因決定著我們的性狀。很多科學(xué)家一直在思考，當(dāng)基因出了問題，我們應(yīng)當(dāng)如何修理呢？晁老師，您能分享一下基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程嗎？

晁彥杰：基因編輯技術(shù)其實已經(jīng)有了較長的歷史。在CRISPR/Cas9問世之前，已經(jīng)有很多科學(xué)研究工作在實驗室中進(jìn)行了。

在這之前，尤其是在低等生物中，如大腸桿菌或者酵母，有很多的嘗試和工具的開發(fā)，但是效率并不高，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法達(dá)到在人體中應(yīng)用的程度。

第一代是較大的鋅指核酸酶，效率非常低。第二代為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶。

在CRISPR開始之前，最有用、最高效的一代就是“鋅指蛋白”基因編輯工具，（這個工具）利用蛋白質(zhì)來識別DNA或進(jìn)行基因編輯。雖然準(zhǔn)確性很高，但效率還是很低。直到近10年前，CRISPR/Cas9的發(fā)明才有了最新一代的基因編輯技術(shù)。

因為CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)，基因編輯技術(shù)的效率被提升到一個非常高的水平，可以真正應(yīng)用于人體研究、哺乳動物的研究，甚至可以應(yīng)用于臨床上的研究和治療。

此前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)有了比較長的歷史和鋪墊。直到近年來，CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了新的突破，因此它成為了一項“明星技術(shù)”。

02 CRISPR/Cas9技術(shù)原理

葉水送：2012年CRISPR/Cas9技術(shù)問世后，很多人關(guān)注“為何這個技術(shù)會產(chǎn)生如此大的影響”，您能介紹一下這個技術(shù)的原理嗎？

晁彥杰：CRISPR/Cas9技術(shù)的問世實際上可以歸功于2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在《Science》上發(fā)表的一篇論文。

Emmanuelle Charpentier

Jennifer Doudna

這兩位女科學(xué)家證明了在體外或大腸桿菌中能夠進(jìn)行基因編輯，為科學(xué)界提供了一種全新的技術(shù)，之后這個技術(shù)引起了很多人的關(guān)注。

然而，后來張鋒和George Church兩位科學(xué)家相繼在《Science》上發(fā)表了兩篇論文，首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)在人類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行大規(guī)模的基因編輯。這實際上是技術(shù)的真正應(yīng)用，因而引起了更多人的關(guān)注。

華人學(xué)者張鋒

這項技術(shù)之所以產(chǎn)生如此大的影響，也是因為它在很短的時間內(nèi)（幾個月或不到一年的時間）就能夠在人類細(xì)胞中實現(xiàn)高效且大規(guī)模的基因編輯。這讓人們看到了基因編輯技術(shù)應(yīng)用的巨大潛力和價值。

這項技術(shù)的原理是使用了一種新型的核酸酶，即Cas9蛋白質(zhì)。

這個核酸酶具有一個特點，那就是它不能隨意切割，而是必須依賴一個核酸作為導(dǎo)引。這個導(dǎo)引就是CRISPR或guide RNA。當(dāng)這個RNA和蛋白質(zhì)組成一個復(fù)合體時，它可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確地切割特定的位點。

只有這樣，基因編輯才能夠?qū)崿F(xiàn)高效且準(zhǔn)確的特性，從而達(dá)到潛在的臨床治療應(yīng)用。因此，可以說是Doudna和Charpentier開創(chuàng)了這個領(lǐng)域的先河。

03 CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢

葉水送：與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9這個技術(shù)有何優(yōu)勢，短板又在哪里？

晁彥杰：CRISPR/Cas9的優(yōu)勢非常多，它可以在最短的時間內(nèi)就達(dá)到“一統(tǒng)天下”的局面，主要就在于它簡便、可行、高效。CRISPR/Cas9的向?qū)褂靡欢魏怂峄騌NA，這個RNA有無限的可能性，可以在體外合成，并且合成效率非常高，成本卻很低。

它可以在幾天內(nèi)合成成千上萬個向?qū)В梢詫o數(shù)個位點、任何一個人體基因、任何一個物種的基因進(jìn)行編輯。這種技術(shù)的高效性是任何一種方法都無法比擬的。

同時，CRISPR/Cas9的時間和經(jīng)濟成本都非常低，可以在短短的幾天之內(nèi)合成向?qū)NA，在哺乳動物細(xì)胞中完成編輯，而且編輯效率非常高，可以在短時間內(nèi)粗略篩選，拿到編輯后的細(xì)胞和產(chǎn)物。

另外一個優(yōu)勢是，CRISPR/Cas9可以同時編輯很多個基因。由于向?qū)NA可以無限組合，可以使用多個向?qū)NA，同時在一個細(xì)胞內(nèi)靶向多個基因。這個優(yōu)勢也是其他方法無可比擬的。

有優(yōu)勢自然也有短板。在臨床中，CRISPR/Cas9的短板就在于編輯有一定的脫靶效應(yīng)，不是在100%位點完成想要的編輯，這個是所有編輯技術(shù)存在的問題。

雖然有這些短板，但目前技術(shù)開發(fā)人員也在嘗試著去提高這項技術(shù)，很多科學(xué)家都在不斷地優(yōu)化、開發(fā)這項技術(shù)。

04 CRISPR/Cas9的開創(chuàng)者

葉水送：我們知道您當(dāng)時也與諾獎得主Emmanuelle Charpentier有些合作，甚至在她的幾篇開山之作里面也有您的署名。您能分享一下這項技術(shù)幾位開創(chuàng)者的故事嗎？Charpentier在發(fā)表《Science》論文之前在做一些什么工作，**有沒有像現(xiàn)在一樣受到這么多關(guān)注？

晁彥杰：我對諾獎得主Emmanuelle Charpentier是相當(dāng)熟悉的。我們同屬于“原核RNA生物學(xué)”這一個較小的領(lǐng)域，在她成功之前，她就和我們實驗室開始了合作。

其實，最開始發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的文章就是由我參與合作的文章。

晁彥杰研究員名字位列其中

在她因這篇文章成名之前，她還是一個職務(wù)較低的課題組長，她在維也納艱難地帶領(lǐng)自己的課題組。

當(dāng)時她就有一個比較感興趣的一個方向，就是在病原細(xì)菌中的鏈球菌，她希望在鏈球菌中能發(fā)現(xiàn)一些新型的非編碼小RNA。

后來她和我們實驗室展開了合作，我們實驗室有著RS測序（單分子實時測序）的技術(shù)和非編碼小RNA的研究基礎(chǔ)。然后，我們就在她病原細(xì)菌的物種中發(fā)現(xiàn)了非編碼小RNA。

當(dāng)時完全是興趣驅(qū)動著這項基礎(chǔ)研究工作，我們完全沒有想到這工作能夠發(fā)表在《Nature》上面，亦或者是能夠產(chǎn)生CRISPR/Cas9這樣一項改變世界的重大研究。

當(dāng)時，我們盡我們所能為這份工作做實驗，發(fā)現(xiàn)在鏈球菌中有一個新型的非編碼小RNA。很巧的是，這個小RNA是跟CRISPR相關(guān)的，而且是跟CRISPR/Cas9相互作用的。

因為這份工作，Charpentier的學(xué)術(shù)發(fā)展也變得非常順利。她離開了維也納大學(xué)，去瑞典建立了一個新的實驗室，后來又回到了德國建立了更大的實驗室。在這個過程中，我們都是有溝通的。

現(xiàn)在Charpentier仍然在病原細(xì)菌的RNA生物學(xué)領(lǐng)域做著非常出色的工作，并在柏林馬普研究所創(chuàng)立了一個新的研究單元。

05 華人學(xué)者的主要貢獻(xiàn)

葉水送：所以說，一個原始創(chuàng)新的技術(shù)在誕生之前往往也是比較艱難的。興趣是最好的老師，我們知道華人科學(xué)家在這個領(lǐng)域做出了非常重要的貢獻(xiàn)，比方說張鋒，他也因此獲得了蓋爾德納獎等重要獎項，**您能介紹一下他和其他幾位華人學(xué)者在這個領(lǐng)域的主要貢獻(xiàn)嗎？

晁彥杰：實際上，我們?nèi)A人科學(xué)家在這個領(lǐng)域做出了非常大的貢獻(xiàn)，尤其是在國內(nèi)生命科學(xué)的發(fā)展和壯大方面，在這個領(lǐng)域中，我們?nèi)A人的貢獻(xiàn)得到了體現(xiàn)。

其中代表就是張鋒，他一直涉足基因編輯這個領(lǐng)域。在CRISPR/Cas9被發(fā)現(xiàn)之前，他就已經(jīng)在美國從事基因編輯工作，應(yīng)該是在丘奇實驗室。他利用鋅指蛋白進(jìn)行基因編輯。

當(dāng)CRISPR/Cas9出現(xiàn)的那一刻，甚至是在文章進(jìn)行的過程中，他聽到了CRISPR/Cas9這個工具，就覺得非常感興趣，非常震撼，認(rèn)為這是未來的方向。因此，他可能是全世界最早涉足CRISPR研究的科學(xué)家之一。

然后，也正是因為這樣子，當(dāng)Doudna和Charpentier于2012年在《Science》發(fā)表文章之后，他們在一年以內(nèi)就已經(jīng)利用這些工具實現(xiàn)了在哺乳動物細(xì)胞中的基因編輯。

所以，張鋒可以說是CRISPR/Cas9應(yīng)用的先驅(qū)科學(xué)家。在此之后，他不僅僅有了這一項工作或者一個應(yīng)用搶了第一個第一，而是在此之后一系列的工作在這個領(lǐng)域生根，做出了很多新的貢獻(xiàn)。比如說，Charpentier和Doudna，利用了CRISPR/Cas9這一個蛋白質(zhì)可以基因編輯。但是張鋒認(rèn)為，這一類的蛋白應(yīng)該有很多，在自然界中有各種各樣的生物多樣性，可以有其他更好、更高效、更有應(yīng)用價值的蛋白質(zhì)。

然后，他就跟美國NCBI做生物信息學(xué)基因發(fā)掘的一個人合作，在各種各樣難以培養(yǎng)的微生物中發(fā)現(xiàn)了許多功能特異的Cas蛋白質(zhì)。然后，利用這些Cas蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了更多的基因編輯技術(shù)或者更精細(xì)的編輯技術(shù)。不光是能夠做基因編輯，他發(fā)現(xiàn)也可以做基因診斷或者檢測。

06 國內(nèi)基因編輯領(lǐng)域優(yōu)秀的工作

葉水送：晁老師，您能簡單地說一下國內(nèi)這個領(lǐng)域中有哪些亮點的工作嗎？

晁彥杰：國內(nèi)的其實有很多做得非常優(yōu)秀的科學(xué)家代表。我們國家在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用利用CRISPR/Cas9去改造動植物，動物養(yǎng)殖有幾個農(nóng)業(yè)院校做得比較好。在猴子中也做出了基因編輯，為臨床研究或者是疾病研究提供了很多的模型。

另外，北京大學(xué)有些學(xué)者能夠在疾病治療里面利用CRISPR，比如嘗試治療HIV或者是傳染性疾病，也做出了非常好的貢獻(xiàn)。

07 基因編輯技術(shù)的優(yōu)化

葉水送：目前，CRISPR/Cas9基因編輯人類脫靶的一些可能性，還有一些AAV載體的遞送、免疫源性等問題，您覺得這個技術(shù)未來如果應(yīng)用于臨床，哪些環(huán)節(jié)還需要進(jìn)行優(yōu)化？

晁彥杰：我覺得遞送系統(tǒng)是一個需要優(yōu)化的地方，因為CRISPR/Cas9仍然是一種細(xì)菌來源的物質(zhì)，或者是一種人體外源的物質(zhì)。把CRISPR/Cas9遞送到人體細(xì)胞中去，在理想的組織細(xì)胞中進(jìn)行理想的編輯，這中間是需要一些過程的。

目前的應(yīng)用僅僅存在于局部的編輯，尤其是視網(wǎng)膜、視神經(jīng)疾病。這是一種采取局部注射到眼球細(xì)胞中去進(jìn)行編輯。這樣并不能應(yīng)用于所有類型的疾病，比如血液病，只能是把血細(xì)胞提取出來，然后在體外進(jìn)行編輯，重新輸回到體內(nèi)。

所以，真正能夠讓CRISPR/Cas9任意地在理想的器官、細(xì)胞中進(jìn)行編輯，還需要進(jìn)行遞送的相關(guān)研究，能夠讓它達(dá)到靶向性地進(jìn)入到理想的目標(biāo)細(xì)胞中去。

另外一種就是基因脫靶。這個研究已經(jīng)是世界上所有的科學(xué)家都在努力的方向。作為一個人體治療或者是基因編輯的工具，如果有任何脫靶的現(xiàn)象發(fā)生，都會整合到人體的基因組中去，然后會遺傳到這個人的下一代、下下一代，會永久地存在于人體的基因史中，所以說，潛在的脫靶可能性影響會是非常深遠(yuǎn)的。

現(xiàn)在世界上所有從事這個領(lǐng)域的科學(xué)家們都希望能夠進(jìn)一步優(yōu)化基因編輯的效率和準(zhǔn)確性。

08 未來基因編輯如何發(fā)展

葉水送：您覺得未來基因治療發(fā)展方向是怎樣的？

晁彥杰：從事生物學(xué)的人都會去欣賞或者是去理解自然的多樣性，這些不同工具的問世其實都是一種生物技術(shù)的發(fā)展。每一種工具都有它們最理想或者是最適合的應(yīng)用場景。

我不覺得基因治療未來就會被其他治療所代替，反而我們應(yīng)該去思考的是有哪些疾病、哪些特定的場景必須使用基因治療來完成。我能想到的是一些罕見病或者遺傳病的研究，因為這些疾病是由于DNA的缺陷或者基因組的缺陷導(dǎo)致的。所以，在DNA水平上進(jìn)行編輯能夠達(dá)到一次編輯就能完全解決問題，這個是基因治療沒有辦法被替代的，是它最適合的治療場景。

然后，mRNA疫苗、蛋白降解實驗仍然是一種正在發(fā)展中的技術(shù)。雖然它在新冠過程中作為疫苗使用的先例，但是它仍然還不夠成熟，尤其是遺傳病治療中。

至于它們最適用什么場景或者解決什么問題，還是有待進(jìn)一步研究的。

本文為科普中國·星空計劃扶持作品
團(tuán)隊/作者：深究科學(xué)
審核：陶寧 中科院生物物理所 副研究員

出品：中國科協(xié)科普部
監(jiān)制：中國科學(xué)技術(shù)出版社有限公司、北京中科星河文化傳媒有限公司