乳酸脫氫酶

分類介紹

根據(jù)結(jié)合輔酶的不同，微生物體一般包含兩種乳酸脫氫酶，NAD-依賴型乳酸脫氫酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依賴型乳酸脫氫酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）兩大類。NAD-非依賴型乳酸脫氫酶，也被稱作呼吸鏈乳酸脫氫酶，在微生物體內(nèi)通常被認(rèn)為是負(fù)責(zé)乳酸氧化的酶類。它們編碼的基因與乳酸利用相關(guān)的乳酸透性酶和調(diào)節(jié)蛋白編碼的基因較近。相較于NAD-非依賴型乳酸脫氫酶，NAD-依賴型乳酸脫氫酶分布范圍更廣泛，在人體、動(dòng)物以及微生物中都普遍存在。在微生物中，NAD-依賴型乳酸脫氫酶存在于其細(xì)胞質(zhì)中，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：NAD-依賴型乳酸脫氫酶能夠以NADH為輔因子催化丙酮酸還原生成乳酸，并且氧化NADH為NAD+，同時(shí)該酶在特定的條件下可以催化逆反應(yīng)的進(jìn)行，但是活力非常弱，不容易檢測(cè)。一般說(shuō)來(lái)，與NAD-依賴型乳酸脫氫酶以NADH為輔因子不同的是NAD-非依賴型乳酸脫氫酶主要利用黃素。NAD-依賴型乳酸脫氫酶也可以在體內(nèi)催化乳酸的氧化，但體外實(shí)驗(yàn)可能需要較高的pH和底物濃度。

按其催化底物的構(gòu)型不同，NAD-依賴型乳酸脫氫酶可以分為NAD依賴型-L-乳酸脫氫酶（L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶）和NAD依賴型-D-乳酸脫氫酶（D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶）兩大類，分別催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。研究表明，雖然L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶和D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶均催化丙酮酸合成乳酸，但二者的基因序列不具有相似性或一致性。已知的不同乳桿菌的D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶之間存在40%～50%的氨基酸同源性，而D-NAD-依賴型乳酸脫氫酶和L-NAD-依賴型乳酸脫氫酶之間則只存在10%左右的同源性，表明兩種脫氫酶分別由兩個(gè)完全不相關(guān)的家族進(jìn)化而來(lái)。不僅如此，酶之間的差異也表現(xiàn)在動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異明顯，比如，兩者催化反應(yīng)的反應(yīng)常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km不同。

根據(jù)天然電子受體的不同，可以將NAD-非依賴型乳酸脫氫酶分為三類。第一類為膜蛋白，利用膜醌類作為外部的電子受體；第二類直接利用O2作為電子受體，根據(jù)氧化終產(chǎn)物的不同，又將其細(xì)分為乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸單氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者產(chǎn)生丙酮酸和H2O2，而后者產(chǎn)生乙酸、CO2和H2O；第三類是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的電子受體為細(xì)胞色素c。大多數(shù)L-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶屬于α-羥酸氧化黃素蛋白家族，利用還原型黃素單核苷酸（Flavin mononuleotide，F(xiàn)MN），而所有的D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶均可利用黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）作為電子受體，而不是FMN，它們具有FAD結(jié)合的氧化還原酶/轉(zhuǎn)移酶4的家族特征。此外，D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶還可以利用醌類或細(xì)胞色素c作為電子受體，但是迄今為止，還沒有D-NAD-非依賴型乳酸脫氫酶直接利用O2的相關(guān)報(bào)道。Wolin的研究表明，一些鏈球菌LDHs的催化活性絕對(duì)依賴于果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-Diphosphate，F(xiàn)DP）。其他鏈球菌、雙歧桿菌屬的所有種、干酪乳桿菌和木糖乳桿菌等都發(fā)現(xiàn)了相似的NAD-非依賴型乳酸脫氫酶。

結(jié)構(gòu)功能

研究表明，L-乳酸脫氫酶（L-LDH）和L-蘋果酸脫氫酶屬于同一家族，而D-乳酸脫氫酶（D-LDH）屬于D-2-羥酸脫氫酶家族。

D-乳酸脫氫酶

大多數(shù)D-乳酸脫氫酶催化是可逆反應(yīng)，極少數(shù)不可逆；對(duì)于可逆的D-乳酸脫氫酶來(lái)說(shuō)，只有環(huán)境中乳酸濃度較高時(shí)才催化逆反應(yīng)，即催化乳酸合成丙酮酸，來(lái)參與細(xì)菌的代謝。

D-乳酸脫氫酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)表明，不同種屬的D-乳酸脫氫酶的氨基酸序列存在較大的差異，但是參與丙酮酸的結(jié)合與催化的氨基酸殘基卻十分保守。Kochhar等的研究顯示L.bulgaricus的D-乳酸脫氫酶是一個(gè)由相同亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基由332個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為36.8 ku，經(jīng)化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)位于催化中心的三個(gè)組氨酸（His205、His296和His303）和Asp259對(duì)底物的催化具有十分重要的作用。Kochhar等還發(fā)現(xiàn)，His289也參與了底物結(jié)合，但His289不是D-2-羥基酸脫氫酶家族中保守的氨基酸殘基。另外，通過(guò)對(duì)Cys殘基的化學(xué)修飾發(fā)現(xiàn)Cys234可能參與底物結(jié)合和催化作用，這在L.helveticus的羥基丙酮酸還原酶中也能得以證實(shí)。研究還發(fā)現(xiàn)L.helveticus CNRZ32 的D-乳酸脫氫酶氨基酸序列和D-2-羥基酸脫氫酶家族的D-3-磷酸甘油酸脫氫酶、羥基丙酮酸還原酶和D-2-羥基己酸脫氫酶存在很高的同源性，這也暗示了該酶是D-2-羥基酸脫氫酶家族的一個(gè)成員。Razeto等對(duì)L.bulgaricus的D-乳酸脫氫酶構(gòu)象進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L. bulgaricus的D-乳酸脫氫酶是一個(gè)由兩個(gè)相同的亞基構(gòu)成的不對(duì)稱酶，A亞基的酶蛋白是典型的“開放”構(gòu)象，而B亞基是典型的“閉合”構(gòu)象。其中NADH的結(jié)合位點(diǎn)主要存在于B亞基中，而在A亞基中僅有30%，同時(shí)在底物結(jié)合口袋中有一個(gè)硫酸根離子。另外，該研究還建立了丙酮酸分子在活性位點(diǎn)的模型。在閉合域中，存在一簇疏水的氨基酸殘基緊緊圍繞著丙酮酸分子的甲基，在這個(gè)疏水氨基酸簇中至少有三個(gè)氨基酸殘基（Tyr52、Phe299和Trp135’）決定底物的專一性。研究表明該底物結(jié)合位點(diǎn)有利于閉合域的穩(wěn)定和酶的激活。

L-乳酸脫氫酶

大多數(shù)乳酸菌中不僅存在D-乳酸脫氫酶也存在L-乳酸脫氫酶，L-乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原生成L-乳酸。L-乳酸脫氫酶分為兩型：一類可被FDP激活，屬于別構(gòu)酶；另一類不需要FDP激活，不具有別構(gòu)效應(yīng)。據(jù)Hiroyuki Uchikoba報(bào)道，L.pentosus的L-乳酸脫氫酶是一個(gè)非異構(gòu)酶，但是它的氨基酸序列和一些細(xì)菌的別構(gòu)LDH具有很高的相似性。該酶的四聚體由相同亞基組成對(duì)稱的酶結(jié)構(gòu)。它的活性構(gòu)象和別構(gòu)LDH的構(gòu)象相似。

Kazuhito Arai等的研究表明，Lactobacillus的L-乳酸脫氫酶氨基酸序列中，Glu102、Asp197和Thr246是高度保守的，它們參與了底物的識(shí)別；另外，98-110氨基酸殘基構(gòu)成了活性位點(diǎn)環(huán)，它們參與催化反應(yīng)。Arg171的胍基和丙酮酸的羰基形成雙氫鍵，從而使丙酮酸在催化位點(diǎn)中處于正確的結(jié)合方向。研究表明，在L-乳酸脫氫酶的氨基酸序列中同樣存在一個(gè)與輔酶NADH結(jié)合的結(jié)構(gòu)域Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-（17Xaa）-Asp，其中該結(jié)構(gòu)域中的Asp決定了L-乳酸脫氫酶的輔酶是NADH，而不是NADPH4]。L.pentosus中L-乳酸脫氫酶的活性位點(diǎn)和其他LDH相似，包括了參與催化與底物結(jié)合的保守氨基酸殘基，如Aspl68、Argl71和Hisl955。其中，Argl71在底物的結(jié)合中起著重要作用；另外，Hisl95主要在催化過(guò)程中作為質(zhì)子供體和受體。值得注意的是，雖然Bacillus 和Lactobacillus的L-乳酸脫氫酶在進(jìn)化關(guān)系上存在很近的親緣關(guān)系，但是活性位點(diǎn)環(huán)的氨基酸殘基也存在差異，如101位Bacillus是Asn，而Lactobacillus是Pro。這表明L-乳酸脫氫酶是否來(lái)自好氧或厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌可以由這個(gè)位置的氨基酸殘基是Asn101還是Pro101來(lái)識(shí)別。

生理生化

半壽期：10-160h。4

穩(wěn)定性：與溫度有很大關(guān)系，不管在什么溫度下保存均可導(dǎo)致酶失活。4

分離純化

從微生物中分離純化乳酸脫氫酶的步驟主要包括細(xì)胞壁破碎、粗酶液的制備（包括離心、鹽析等）、酶的分離純化等。由于柱層析法分辨率較高，在乳酸脫氫酶分離純化中較常使用。

測(cè)定方法

原理

乳酸脫氫酶催化乳酸至丙酮酸之間的可逆性反應(yīng)，目前正反兩個(gè)方向的反應(yīng)均能測(cè)定，由于逆反應(yīng)的速度比正反應(yīng)快4倍，測(cè)得的活性也高得多，因此采用不同反應(yīng)方式的試劑盒得出的結(jié)果也不相同。6

1994年IFCC推薦的參考方法為從乳酸至丙酮的正反應(yīng)。6

L-乳酸+氧化型輔酶Ⅰ→丙酮酸+還原型輔酶Ⅰ1

參考值

血清：35-88U/L（pH8.8-9.0 ，30°C）； 100-225U/L（pH8.8-9.0，37°C）。6

尿：42-98U/L（pH8.8-9.0，25°C，連續(xù)監(jiān)測(cè)LD-L法）。6

血清：200-380U/L（連續(xù)監(jiān)測(cè)LD-P法）。6

血清：95-200U/L（pH7.4 ，30°C ；200-380U/L（pH7.4，37°C）。6

腦脊液：7-30U/L（pH7.4，30°C ，比色法）。6

臨床意義

乳酸脫氫酶升高常見于：1

（1）心肌梗死：心肌梗死后9-20h開始上升，36-60h達(dá)到高峰，持續(xù)6-10天恢復(fù)正常，因此可作為急性心肌梗死后期的輔助診斷指標(biāo)。1

（2）肝臟疾?。杭毙愿窝住⒙曰顒?dòng)性肝炎、肝癌、肝硬化、阻塞性黃疸等。1

（3）血液?。喝绨籽?、貧血、惡性淋巴瘤等。1

（4）骨骼肌損傷、進(jìn)行性肌萎縮、肺梗死等。1

（5）惡性腫瘤轉(zhuǎn)移所致胸、腹水中乳酸脫氫酶活力往往升高。1

乳酸脫氫酶降低無(wú)意義。6

注意事項(xiàng)

由于紅細(xì)胞內(nèi)LDH活性比正常血清中LDH活性高1000倍，溶血時(shí)血清LDH活性顯著增高，故送檢標(biāo)本不能溶血。由于草酸鹽抑制LDH，故測(cè)LDH活性，宜采用血清而不采用血漿。另外，若血清中未除盡血塊，無(wú)論在4℃還是室溫存放標(biāo)本，LDH活性都將明顯增高。6

主要作用

乳酸脫氫酶是微生物中催化苯丙酮酸生成苯乳酸（phenyllactic acid，PLA，C9H10O3，也稱2-羥基-3-苯基丙酸）的一類關(guān)鍵酶。乳酸脫氫酶是生物體內(nèi)糖酵解途徑中一種至關(guān)重要的氧化還原酶，能可逆地催化乳酸氧化為丙酮酸，該催化反應(yīng)是無(wú)氧糖酵解的最終產(chǎn)物。6乳酸脫氫酶主要存在于心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等動(dòng)物組織中。乳酸脫氫酶測(cè)定常用于診斷心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤。1

同工酶

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一類NAD依賴性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基，可構(gòu)成6種四聚體同工酶。動(dòng)物乳酸脫氫酶是由4個(gè)亞單位組成的四聚體，是一個(gè)具有5種同工酶形態(tài)的分子，即常見的A、B兩種亞基構(gòu)成的5種LDH同工酶（LDH1～5）。C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。用電泳的方法可以將人和動(dòng)物組織的LDH分離出5種LDH同工酶。4

人血清中含有5種同工酶1，按其組織來(lái)源來(lái)說(shuō)，LD1和LD2主要來(lái)源于心肌，臨床常用的α-羧基丁酸脫氫酶（α-HBD）實(shí)際上就是LD1和LD2的活性之和；LD3主要來(lái)源于肺、脾；LD4和LD5（特別是LD5）主要來(lái)源于肝和骨骼肌。4正常人血清中LD同工酶活性大小順序?yàn)椋篖D2>LD，>LD4>LD3，不少疾患不僅有LD總活性變化，而且由于病變的臟器不同，各個(gè)同工酶變化也不一致。1

正常參考值

瓊脂糖電泳法：

LDH1（28.4±5.3）%；

LDH2（41.0±5.0）%；

LDH3（19.0±4.0）%；

LDH4（6.6±3.5）%；

LDH5（4.6±3.0）%。

醋酸纖維素薄膜法：

LDH1（25.32±2.62）%

LDH2（34.36±1.57）%

LDH3（21.86±1.38）%

LDH4（11.3±1.84）%

LDH5（7.97±1.59）%

聚丙烯酰胺法：

LDH1（26.9±0.4）%

LDH2（36.0±0.5）%

LDH3（21.9±0.4）%

LDH4（11.1±0.4）%

LDH5（4.1±0.3）%

健康成人血清LDH同工酶有如下的規(guī)律：LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4＞LDH5。

臨床意義

心肌細(xì)胞LD活性遠(yuǎn)高于血清數(shù)百倍，尤以LDH1和LDH2含量最高。急性心肌梗塞時(shí)，血清LDH1和LDH2顯著升高，約95%的病例的血清LDH1和LDH2比值大于1，且LDH1升高早于LDH總活性升高。病毒性和風(fēng)濕性心肌炎及克山病心肌損害等，病人的血清LDH同工酶的改變與心肌梗塞相似。LDH1/LDH2比值＞1還見于溶血性貧血、惡性貧血、鐮形細(xì)胞性貧血、腎臟損傷、腎皮質(zhì)梗塞、心肌損傷性疾病、瓣膜病等。

腦干含LDH1較高。頗腦損傷僅累及大腦半球時(shí)，只有血清同工酶譜的絕對(duì)值增高，而不影響同工酶的相互比值，如果累及腦干時(shí)，病人血清LDH1的含量也增高。

急性心肌梗塞發(fā)病后12～24小時(shí)，血清LDH1業(yè)已升高。若同時(shí)測(cè)定LD總活性，可發(fā)現(xiàn)LDH1/總LDH的比值對(duì)急性心肌梗塞診斷的陽(yáng)性率與可靠性優(yōu)于單純測(cè)定LDH1或CK-MB。

胚胎細(xì)胞瘤病人的血清LDH1活性升高。

肝細(xì)胞損傷或壞死后，向血流釋入大量的LDH4和LDH5，致使血中LDH5/LDH4比值升高，故LDH5/LDH4＞1可做為肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)。急性肝炎以LDH5明顯升高，LDH4不增，LDH5/LDH4＞1為特征；若血清LDH5持續(xù)升高或下降后再度升高，則可認(rèn)為是慢性肝炎；肝昏迷病人的血清LDH5、LDH4活性極高時(shí)，常示預(yù)后不良；原發(fā)性肝癌以血清LDH4＞LDH5較為常見。

腎皮質(zhì)以LDH1和LDH2含量較高，腎髓質(zhì)以LDH4和LDH5活性較強(qiáng)?；技毙阅I小管壞死、慢性腎盂腎炎、慢性腎小球腎炎以及腎移植排異時(shí)，血清LDH5均可增高。

肺含LDH3較多，肺部疾患時(shí)血清LDH3?？缮摺７喂Ｈ麜r(shí)LDH3和LDH4相等，LDH1明顯下降；肺膿腫病人的血清LDH3、LDH4常與LDH5同時(shí)升高。

血清LD總活性升高而同工酶譜正常（LDH1/LDH2＜1）的病例，臨床出現(xiàn)率依次為；心肺疾病、惡性腫瘤、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患、炎癥、肝硬變、傳染性單核細(xì)胞增多癥、甲狀腺機(jī)能低下、尿毒癥、組織壞死、病毒血癥、腸梗阻等。

肌營(yíng)養(yǎng)不良病人肌肉中LDH1、LDH2明顯增高，LDH5顯著下降；而血清則相反，LDH1、LDH2明顯減少，LDH4、LDH5顯著，表明血清LDH同工酶主要來(lái)自肌肉組織。煤礦、鎢礦矽肺病人的血清LDH1、LDH2下降，LDH4、LDH5升高。

（4）惡性病變時(shí)LDH3常增高。