【CACA周刊-學(xué)科新知】cfDNA在淋巴瘤診斷和預(yù)后預(yù)測中的價(jià)值

前言概述

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學(xué)科新知聚焦業(yè)內(nèi)權(quán)威專家，從學(xué)科發(fā)展的高度全面梳理、深入解讀腫瘤醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與進(jìn)展，為醫(yī)護(hù)以及科研人員立體勾勒惡性腫瘤領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，賦能臨床科研和學(xué)術(shù)推廣，為醫(yī)學(xué)研究者搭建一個(gè)共享知識(shí)、交流經(jīng)驗(yàn)的平臺(tái)，推動(dòng)腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的國際化合作與發(fā)展。

本期學(xué)科新知分享的是蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院李炳宗教授對(duì)淋巴瘤cfDNA診斷和預(yù)后預(yù)測進(jìn)展的精彩解讀。

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cfDNA的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

活檢，是“活體組織檢查”簡稱，亦稱外科病理學(xué)檢查，是指應(yīng)診斷、治療的需要，從患者體內(nèi)切取、鉗取或穿刺等取出病變組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查的技術(shù)?；顧z是診斷病理學(xué)中最重要的部分，對(duì)絕大多數(shù)送檢病例都能做出明確的組織病理學(xué)診斷，被作為臨床的最后診斷。在惡性腫瘤的診療中，影像學(xué)檢查，如CT掃描或MRI，有助于檢測腫塊或不規(guī)則組織，但僅憑這些檢查無法區(qū)分癌性細(xì)胞和非癌性細(xì)胞。病理診斷則被公認(rèn)為惡性腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在此過程中，活檢是必不可少的步驟。

液體活檢，也稱為液態(tài)活檢或液相活檢，指以體液為檢材獲得腫瘤生物信息的體外診斷技術(shù)?？捎糜谝后w活檢的體液包括血液、尿液、糞便、腦脊液、唾液、胸腔或腹盆腔積液等，檢測對(duì)象主要有游離核酸、腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡、血小板等。

人體細(xì)胞凋亡和壞死后會(huì)釋放片段化DNA到體液中，稱為游離DNA（cfDNA）。cfDNA長度主要分布在一個(gè)核小體的范圍內(nèi)，長度約為166 bp，其次分布于300 bp（雙核小體）和500 bp（三核小體）范圍。cfDNA的半衰期很短，約為30 min~2 h，其含量的變化可以更實(shí)時(shí)地反映腫瘤負(fù)荷[1]。在健康人群正常器官組織來源的cfDNA中，淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的脫落DNA所占比例最大。在cfDNA中，部分來自腫瘤細(xì)胞的DNA則被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。ctDNA會(huì)攜帶來源于腫瘤細(xì)胞相關(guān)的遺傳學(xué)特征，如基因突變、甲基化、擴(kuò)增或重排等，可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評(píng)估及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層的重要指標(biāo)。

在健康人血清中，cfDNA的含量為0~100 ng/ml，平均約為30 ng/ml，而腫瘤患者血清中的含量差異較大，在0~1000 ng/ml，平均約為180 ng/ml?；诖?，血液cfDNA含量的檢測對(duì)于腫瘤早期診斷和治療后監(jiān)測具有顯著價(jià)值。國內(nèi)首個(gè)前瞻性、盲法、獨(dú)立驗(yàn)證研究（THUNDER）發(fā)現(xiàn)在肺癌、腸癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌和食管癌6大癌種中基于cfDNA的液體活檢在癌癥早篩的獨(dú)立驗(yàn)證中可達(dá)到98.9%的特異性、69.1%的敏感性以及83.2%的組織溯源準(zhǔn)確性。在真實(shí)世界模擬中實(shí)現(xiàn)了70.6%的靈敏度，可將晚期發(fā)病率降低38.7%-46.4%，五年生存率提高33.1%-40.4%[2]。

淋巴瘤是一類起源于淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。目前診斷淋巴瘤和評(píng)估腫瘤生物學(xué)特征仍然主要依賴于病變組織的組織病理活檢。然而組織病理活檢有些情況下面臨著取材困難的問題，而影像學(xué)評(píng)估始終面臨敏感性不足和對(duì)腫瘤負(fù)荷精確定量困難的難題。此外，基于PHOENIX和RUBUST研究的失敗結(jié)果，也表明基于細(xì)胞起源的病理分型無法準(zhǔn)確指導(dǎo)靶向藥物的治療，而根據(jù)基因分型及相關(guān)的信號(hào)通路異常來指導(dǎo)各種分子靶向藥物在淋巴瘤治療中的應(yīng)用是有臨床價(jià)值的[3，4]。

國外的一項(xiàng)使用cfDNA甲基化特征在多癌種的檢測與定位的研究開發(fā)了用于癌癥檢測和組織起源定位的分類器，發(fā)現(xiàn)其在驗(yàn)證集中特異性可達(dá)99.3%，假陽性率為0.7%。檢測率隨著分期的增加而增加：在預(yù)先指定的癌癥類型中，Ⅰ期敏感性為39%，Ⅱ期敏感性為69%，Ⅲ期為83%，Ⅳ期為92%。在所有癌癥類型中，Ⅰ期敏感性為18%，Ⅱ期敏感性為43%，Ⅲ期敏感性為81%，Ⅳ期為93%。在淋巴瘤中，訓(xùn)練集的敏感性在Ⅰ期（n=15）約為23%，Ⅱ期（n=28）約為75%，Ⅲ期（n=27）約為78%，Ⅳ期（n=39）約為80%；驗(yàn)證集的敏感性在Ⅰ期（n=7）約為60%，Ⅱ期（n=12）約為100%，Ⅲ期（n=12）約為85%，Ⅳ期（n=39）約為100%。此外，通過混淆矩陣表示訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中組織溯源的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤中，訓(xùn)練集具有高達(dá)92%的準(zhǔn)確率，同時(shí)，驗(yàn)證集中的準(zhǔn)確性也可達(dá)85%。因此，基于cfDNA信息甲基化模式的測序在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性階段檢測中的特異性及敏感性可接近人群水平篩查的目標(biāo)[5]。

綜合上述研究結(jié)果，基于cfDNA的檢測方法具有特異性高、敏感性高等特性。非侵入性的檢測方式也為患者提供諸多便利。

2

cfDNA在常見淋巴瘤診斷和預(yù)后預(yù)測中的價(jià)值

淋巴瘤在原發(fā)腫瘤內(nèi)和跨疾病部位都表現(xiàn)出空間異質(zhì)性。隨著時(shí)間的推移和治療壓力的影響，克隆選擇和進(jìn)化可導(dǎo)致額外的臨床相關(guān)異質(zhì)性。因此，單次活檢可能無法反映疾病生物學(xué)的全部。由于cfDNA包含從所有疾病部位脫落的分子，因此該檢測可以更準(zhǔn)確地描述相關(guān)突變。此外，在解剖學(xué)困難的部位，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）淋巴瘤或放射學(xué)上隱匿性疾病中可能無法進(jìn)行活檢。雖然切除活檢仍然是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但液體活檢方法可能在診斷和復(fù)發(fā)的基因分型中發(fā)揮越來越重要的作用。

在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中，一項(xiàng)從游離DNA片段譜推斷基因表達(dá)的研究當(dāng)中，通過基于cfDNA片段特征開發(fā)了表觀遺傳表達(dá)推斷（EPIC-seq）分析方法。通過EPIC-seq技術(shù)對(duì)DLBCL患者的預(yù)處理血液樣本進(jìn)行分析檢測cfDNA中的表觀遺傳信號(hào)，從而非侵入性地識(shí)別DLBCL病例，并區(qū)分癌癥患者與健康對(duì)照者。在訓(xùn)練集中，此技術(shù)在區(qū)分DLBCL患者（n=91）和非癌癥對(duì)照者（n=71）時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)大的性能（AUC=0.92）。在應(yīng)用于DLBCL患者（n=23）和非癌癥對(duì)照參與者（n=23）的驗(yàn)證隊(duì)列時(shí)，觀察到在區(qū)分癌癥和非癌癥方面有相似的表現(xiàn)（AUC=0.96）。在治療期間，患者的EPIC-seq評(píng)分顯示出與ctDNA濃度隨時(shí)間變化的強(qiáng)烈且顯著的相關(guān)性，表明依據(jù)cfDNA可以無創(chuàng)地檢測組織來源的DLBCL信號(hào)，并真實(shí)反映DLBCL治療前后的疾病負(fù)擔(dān)。在DLBCL的亞型分類中，基于EPIC-seq分析的結(jié)果可明顯區(qū)分GCB亞型與ABC亞型，相比于Hans算法，此類無創(chuàng)分類方法可更好地對(duì)患者進(jìn)行分型[6]。

此外，國外學(xué)者也通過定向變異（PVs）富集和檢測測序（PhasED-seq）的方法，通過測定單個(gè)DNA片段中的多個(gè)體細(xì)胞突變來提高ctDNA檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)其在治療期間和復(fù)發(fā)之前都能有效提高臨床樣本的ctDNA陽性檢測率，且能應(yīng)用于實(shí)體瘤患者。從三個(gè)獨(dú)立的DLBCL患者的全基因組測序（WGS）中識(shí)別可能存在的PVs并追蹤殘留病灶，結(jié)果表明，PhasED-seq檢測出的單核苷酸變異（SNV）和PVs的數(shù)量有顯著提高。在比較PhasED-seq與其他ctDNA檢測方法（CAPP-seq或雙鏈測序）中，研究團(tuán)隊(duì)將三名淋巴瘤患者中提取出ctDNA并將其稀釋到健康對(duì)照cfDNA中，結(jié)果表明PhasED-seq的測序錯(cuò)誤率更低且對(duì)ctDNA的檢測率顯著提高。通過對(duì)一名接受治療的DLBCL患者的cfDNA測序進(jìn)行檢測實(shí)用性應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)CAPP-seq僅在患者經(jīng)過一個(gè)周期的治療后就無法檢測到ctDNA，經(jīng)250天后可檢測出，五個(gè)月后患者便出現(xiàn)了臨床疾病進(jìn)展。與此相反的是通過CAPP-seq檢測不到的ctDNA可由PhasED-seq檢出，大大提前了ctDNA的檢測時(shí)間。隨后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步評(píng)估了phasED-seq在107名接受標(biāo)準(zhǔn)免疫化療的B細(xì)胞淋巴瘤患者中的表現(xiàn)，結(jié)果也都表明PhasED-seq檢測ctDNA的優(yōu)越性[7]。

在經(jīng)CAR-T治療后失敗的大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，通過cfDNA的低通全基因組測序（lpWGS）以確定DNA拷貝數(shù)改變（CNA）。表示基因組不穩(wěn)定性的高局灶性CNA評(píng)分（FCS）在多變量選擇中，是與較差的3個(gè)月完全緩解率、無進(jìn)展生存期和總生存期相關(guān)的最重要的預(yù)處理變量。研究共在89%（108/122）患者中發(fā)現(xiàn)34個(gè)獨(dú)特的局灶性CAN。其中，導(dǎo)致FAS死亡受體喪失的10q23.3缺失與不良結(jié)局的相關(guān)性最高，導(dǎo)致PFS和OS較差。研究還發(fā)現(xiàn)高FCS與超過1個(gè)淋巴結(jié)外病變部位相關(guān)，但與反映腫瘤體積增加的疾病特征，例如乳酸脫氫酶（LDH）升高不存在關(guān)聯(lián)?；诖税l(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了包含高FCS、升高的LDH和>1淋巴結(jié)外位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)分層模型，發(fā)現(xiàn)此模型可以識(shí)別出CRA-T治療后12個(gè)月時(shí)PFS僅為4%的高風(fēng)險(xiǎn)患者組[8]。

在套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）中，對(duì)于37名復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者（18名MCL患者）聯(lián)合使用BTK抑制劑（ibrutinib）和泛PI3K抑制劑（buparlisib）治療進(jìn)行了一項(xiàng)單中心Ⅰ/Ⅰb期試驗(yàn)，并在之后進(jìn)行cfDNA樣本的連續(xù)監(jiān)測。研究發(fā)現(xiàn)，血漿ctDNA突變與腫瘤突變高具有度一致性。在MCL患者樣本中，在基線血漿樣本中檢測到患者攜帶MSI1 N247S和TET2 H877L突變，而在該患者的腫瘤樣本中未發(fā)現(xiàn)這些突變。此外，在可檢測到ctDNA的MCL患者中，ctDNA的變化與患者的治療響應(yīng)和疾病進(jìn)展緊密相關(guān)，并且在部分復(fù)發(fā)患者中，ctDNA的增加先于影像學(xué)上的復(fù)發(fā)跡象。ctDNA的動(dòng)態(tài)變化能夠反映腫瘤負(fù)荷和預(yù)測復(fù)發(fā)，揭示疾病進(jìn)展的早期信號(hào)，在監(jiān)測治療效果和疾病演變方面具有敏感性。耐藥性檢測方面，血漿ctDNA測序揭示了治療過程中可能出現(xiàn)的耐藥性突變，早于影像學(xué)進(jìn)展[9]。

T細(xì)胞淋巴瘤是一種高度侵襲性的腫瘤，具有顯著的異質(zhì)性。在血管免疫母細(xì)胞亞型中，ctDNA中的G17V RHOA突變被證明在預(yù)測腫瘤DNA突變狀態(tài)方面具有100%的敏感性和特異性[10]。在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤亞型中，配對(duì)基線腫瘤組織和cfDNA的基因分型結(jié)果之間具有一致性，cfDNA濃度較低時(shí)患者具有更好的生存結(jié)果[11]。另一項(xiàng)研究也顯示治療后未檢測到ctDNA的患者的完全緩解率高于治療后持續(xù)檢測到ctDNA的患者[12]。cfDNA/ctDNA在淋巴瘤治療后微小殘留病灶（MRD）評(píng)估中也具有極大的潛力。在檢測同種異體造血干細(xì)胞移植的淋巴瘤患者中MRD的存在與復(fù)發(fā)/進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)的研究中，84%（16/19）患者在復(fù)發(fā)/進(jìn)展前3.7個(gè)月內(nèi)檢測到了ctDNA。同ctDNA陰性患者相比，同種異體造血干細(xì)胞移植后三個(gè)月可檢測到ctDNA的患者的無進(jìn)展生存率較低。因此基于ctDNA的檢測在T細(xì)胞淋巴瘤的診斷、預(yù)后、治療反應(yīng)評(píng)估和MRD評(píng)估中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。

大多數(shù)經(jīng)典霍奇金淋巴瘤患者要么治療過于集中而遭受不必要的副作用，要么治療不夠集中而出現(xiàn)復(fù)發(fā)，因而個(gè)體化治療在改善治療結(jié)果及減少副作用方面十分必要。在個(gè)體化治理策略中可通過準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行預(yù)先治療，或準(zhǔn)確評(píng)估治療反應(yīng)以在治愈后立即停止治療。國外學(xué)者團(tuán)隊(duì)基于此設(shè)計(jì)一個(gè)有針對(duì)性的ctDNA測序和生物信息學(xué)平臺(tái)，以期在隨訪期間進(jìn)行準(zhǔn)確的基線基因分型和MRD檢測。團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)cfDNA的檢測可在0.5%的突變等位基因頻率（mAF）下實(shí)現(xiàn)高度敏感和特異的突變檢測。該技術(shù)能可靠地區(qū)分出低至0.025% mAF的MRD。臨床驗(yàn)證階段，通過比對(duì)cfDNA樣本中的檢測到的變異與活檢樣本相比，可確認(rèn)所有mAF大于4%的突變（26/26）和91.3%的所有突變（63/69）。對(duì)于拷貝數(shù)評(píng)估，研究將cfDNA中9p24.1區(qū)域（PD-L1基因所在位置）的增益與熒光原位雜交（FISH）這一金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了對(duì)比，二者之間存在強(qiáng)相關(guān)性，顯示出cfDNA在檢測診斷中的巨大潛力[14]。

cfDNA在淋巴瘤中的應(yīng)用不僅增強(qiáng)了疾病的分子層面理解，也為患者提供了更加精準(zhǔn)的治療監(jiān)測和管理手段，是推動(dòng)淋巴瘤個(gè)體化醫(yī)療向前發(fā)展的重要工具。

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中國智慧助力cfDNA光明未來

在2023年第65屆美國血液學(xué)會(huì)（ASH）年會(huì)中，一項(xiàng)“腦脊液和血漿循環(huán)游離DNA在新診斷彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的診斷和預(yù)后價(jià)值”成功入選口頭報(bào)告環(huán)節(jié)，展示了中國學(xué)者在此領(lǐng)域的探索與創(chuàng)新[15]。

研究入組了43例DLBCL患者（更大樣本的檢測和驗(yàn)證還在進(jìn)行中），32例患者血漿cfDNA檢測出基因突變，陽性率達(dá)到74%（32/43），遠(yuǎn)高于外周血基因組DNA檢測出的陽性率（16%）。其中，28/39（72%）例患者腫瘤組織和血漿cfDNA結(jié)果一致，均為陽性。較高的一致性有助于精確診斷和MRD監(jiān)測。此外，4例患者無法獲取腫瘤組織，但cfDNA檢測為陽性。這也體現(xiàn)出cfDNA輔助診斷對(duì)于血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤或者其他采樣困難患者的重要性。

相較于骨髓或原發(fā)病灶組織，14/28（50%）例患者血漿cfDNA中檢測出更多突變，更好地反映了腫瘤的異質(zhì)性。7/30例患者腦脊液cfDNA檢測出陽性，其中，3例患者有明確中樞侵犯證據(jù)，4例患者腦脊液暫時(shí)無細(xì)胞學(xué)、流式或影像學(xué)異常證據(jù)?？梢钥闯?，cfDNA陽性結(jié)果可能作為一種預(yù)測早期中樞復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。目前，我們也在密切觀察這些患者的臨床狀態(tài)。

此外，利用多功能檢測套組同時(shí)檢測出點(diǎn)突變（SNV/Indel）、基因拷貝數(shù)變異（CNV）、Ig相關(guān)融合及克隆性免疫球蛋白基因重排，對(duì)于提高cfDNA陽性檢出率，進(jìn)一步探討DLBCL分子機(jī)制以及協(xié)助臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估都具有非常重要的意義。

淋巴血液病理專業(yè)診斷醫(yī)技人員短缺，實(shí)驗(yàn)室建設(shè)、質(zhì)量控制和專業(yè)人員培訓(xùn)水平參差不齊，一定程度上影響了我國淋巴瘤精準(zhǔn)診治前進(jìn)的步伐。為實(shí)現(xiàn)“千變?nèi)f化”的淋巴瘤診療工作規(guī)范化和同質(zhì)化，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科依據(jù)CACA指南進(jìn)行了試點(diǎn)和改革。作為江蘇省臨床重點(diǎn)?？坪吞K州大學(xué)附屬第二醫(yī)院淋巴瘤中心依托單位，該科室依據(jù)“MDT to HIM”理念，聯(lián)合病理科、影像科、核醫(yī)學(xué)科和放療科等多個(gè)學(xué)科組建淋巴瘤MDT團(tuán)隊(duì)和CAR-T細(xì)胞MDT團(tuán)隊(duì)，致力于淋巴瘤的規(guī)范化和精準(zhǔn)化整合診治。相關(guān)建設(shè)成果于2023年8月獲批全國第一批國家淋巴瘤規(guī)范診療質(zhì)量控制試點(diǎn)單位。未來，地方性淋巴瘤診療機(jī)構(gòu)將主要依托國家級(jí)淋巴瘤病理中心基地開展繼續(xù)教育與專業(yè)人才培訓(xùn)工作，致力于將淋巴瘤診療規(guī)范化、同質(zhì)化。國家級(jí)淋巴瘤病理中心和國家級(jí)淋巴瘤臨床診療中心直接對(duì)接，建立完整的技術(shù)平臺(tái)和相對(duì)充分的醫(yī)療、師資人力資源和教學(xué)、科研條件十分重要。近年來多組學(xué)研究為淋巴瘤的診療提供了諸多新思路，通過研究DNA、RNA、蛋白質(zhì)、表觀遺傳和代謝產(chǎn)物等的構(gòu)成以及在特定條件下這些組分間的相互作用和關(guān)系，融合分析尋找精準(zhǔn)的診療靶點(diǎn)，結(jié)合預(yù)測模型篩選高?；颊撸罱K實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)分層的個(gè)體化治療模式使患者獲益。而這些先進(jìn)技術(shù)的開展與落地臨床是未來5年發(fā)展的重中之重。

中國抗癌協(xié)會(huì)組織權(quán)威專家編寫完成并發(fā)表的《CACA指南-淋巴瘤》反映了我國淋巴瘤治療領(lǐng)域的最新進(jìn)展，整合了國內(nèi)外淋巴瘤診療領(lǐng)域最好的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和臨床經(jīng)驗(yàn)，將深入指導(dǎo)中國淋巴瘤規(guī)范化、正規(guī)化診斷，促進(jìn)治療水平的提升。

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