登上Science?？腃RISPR技術究竟是啥？

作者：李輝（中國科學院青島生物能源與過程研究所）

文章來源于科學大院公眾號（ID：kexuedayuan）

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2018年8月31日，著名的學術期刊Science推出了“技術轉化生物學專刊”，介紹了幾種革命性的生物技術，其中一種就是基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術。

（圖片來源：網(wǎng)絡）

CRISPR技術的來頭可不簡單，今年上半年，36歲的華人學者張鋒教授當選美國文理科學院和美國科學院院士。他的主要貢獻之一就是將一種免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas開發(fā)成基因編輯工具，而之前CRISPR技術也曾分別在2013年和2015年入選SCIENCE雜志評選的年度十大科技進展。 今天大院er就讓你迅速看懂傳說中的CRISPR技術！

CRISPR-Cas系統(tǒng)是何方神圣

它是在細菌和古菌中廣泛存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)，被細菌和古菌當作抵抗病毒和外源質粒的殺手锏之一。

它由兩部分結構組成，第一部分是CRISPR位點，CRISPR位點中存貯著宿主曾經消滅過的病毒或者外源質粒的特征序列，第二部分是表達CRISPR相關蛋白（CRISPR相關的英文縮寫為Cas）的基因，CRISPR相關蛋白就是CRISPR-Cas系統(tǒng)的“殺器”，一般具有核酸酶活性，能夠降解DNA。

CRISPR-Cas系統(tǒng)對抗并消滅病毒和外源質粒的過程可以分成三個階段，分別是試探（外源DNA的獲?。?、破招（CRISPR RNA的加工）和制勝（gRNA介導的降解）。

試探：在這個階段，CRISPR-Cas系統(tǒng)從初次入侵的病毒和質粒中選取一段特異的DNA序列（spacer）插入到自身的CRISPR位點，算是掌握了侵入病毒和外源質粒的特點，擁有了對抗他們的能力。

破招：第二個階段發(fā)生在同樣的病毒和外源質粒再次侵入時，這時含有前一階段所獲取的spacer的CRISPR位點被轉錄，轉錄產物進一步被加工成成熟的gRNA（指導RNA），這些gRNA的產生是能夠最終消滅掉入侵的病毒或外源質粒的關鍵，它們可以指導Cas蛋白靶向到相應的病毒或質粒。

制勝：這個階段，Cas蛋白開始起作用，它會利用它的核酸酶活性在gRNA 介導Cas蛋白靶向到目的病毒或質粒后，把病毒和質粒進行降解，降解完成后， CRISPR-Cas系統(tǒng)在和病毒及外源質粒的較量中就取得了勝利。

CRISPR-Cas9是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一種，目前基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術是同類型技術中應用最廣泛的一種。如果要把CRISPR-Cas9開發(fā)成基因編輯工具，我們需要設計能夠介導Cas9蛋白靶向到目標DNA的gRNA ，此外還需要提供和被編輯位點兩端序列一致，中間含有序列被修改過的供體DNA，這樣以來在Cas9蛋白將目標DNA切割后，供體DNA便可以和目標位點發(fā)生重組，從而對目標位點完成編輯。

CRISPR技術 強在哪里？

和傳統(tǒng)的基因編輯技術相比，CRISPR具有諸多的優(yōu)勢。

CRISPR基因編輯技術大大縮短了對目的基因編輯的時間。在CRISPR基因編輯發(fā)明之前，要拿到一個滿足需求的轉基因小鼠需要一個博士后一年的時間，而使用這項技術在標準化的流程下需要的時間可以減少到一個月。

CRISPR基因編輯技術同時也大大降低了基因編輯的成本。之前，利用基于鋅指酶的基因編輯技術來編輯人體內一個編碼網(wǎng)格蛋白的基因時，每個能夠靶向特定序列的鋅指酶需要花費25000美元，而利用CRISRP基因編輯技術，相應的序列和酶只需要數(shù)十美元。

CRISPR的高效率使得對多個位點同時進行編輯的可能性大大增加。利用傳統(tǒng)的基因編輯技術一般只能對單個位點進行編輯，而目前利用基于CRISPR-Cas9的基因編輯在真核生物中最多可以對7個位點同時進行編輯，而另外一種類型的CRISRP系統(tǒng)CRISPR-Cpf1，相應的位點是4個。

CRISPR對目的位點強大的切割能力為它贏得了“基因魔剪”的美譽，而如果把Cas9蛋白的或者經過改造后的Cas9蛋白和其它具有其它功能的蛋白聯(lián)用，CRISPR所能實現(xiàn)的功能就更多了，包括外源基因的敲入、內源基因的敲除、敲降、對基因組DNA進行表觀修飾和對單堿基進行編輯等等，所以用“遺傳軍刀”去類比它可能更加合適。

適用范圍廣也是這個技術一個非常突出的特點，自2012年CRISPR被證明能改造成基因編輯工具之后， 2013年MIT的張鋒教授和哈佛大學的George Church教授迅速將其用于人體細胞的編輯。隨后，CRISPR基因編輯技術也被成功的證明可以用于小鼠、斑馬魚、大鼠、果蠅、線蟲、擬南芥、粗糙脈胞菌、食蟹猴、兔子、豬、山羊和人等物種的基因組編輯。

圖片來源：網(wǎng)絡

CRISPR應用之一：消滅瘧疾

瘧疾每年造成超過50萬人死亡，其病原體由蚊子攜帶。如果能夠降低蚊子的生殖能力，也就能夠消滅瘧疾了。在這個過程中CRISPR-Cas9系統(tǒng)也可以大顯身手。

基因驅動技術是一種能夠將特定性狀在一個種群中快速傳播的技術，這個功能的實現(xiàn)依賴于一種“自私”的基因，這類基因的產物一般是位點特異性的核酸內切酶，能夠切割同源染色體上與其位置相同的序列，之后以自身為模板，對被切割的序列進行修復，使得同源染色體上相應的序列和自己相同，從而增加了自身序列被傳遞到子代的概率。如果把相應的基因驅動系統(tǒng)放置到能夠導致蚊子雌性不育的基因之內，那么雌性不育這一性狀就會在種群中快速傳播，最終子代蚊子形成的種群中的性別會失衡，蚊子數(shù)量會下降，也就間接地達到了消滅瘧疾的效果。

圖片來源：網(wǎng)絡

CRISPR-Cas9對目標位點準確、高效地切割能力以及CRISPR-Cas9可以被改造成“自私”的基因這兩個特點使得消滅蚊子成為可能。由CRISPR-Cas9衍生的基因驅動系統(tǒng)由兩個部分組成，一是含有能夠靶向同源染色體上和基因驅動系統(tǒng)處于相同位置的gRNA，二是Cas9蛋白的編碼基因。擁有了gRNA和Cas9蛋白，可以在同源染色體上相應的位置進行切割，染色體被切割后有兩種結果，一是如上所述以含有基因驅動系統(tǒng)的染色體為模板進行重組，我們最終得到雌性不育的蚊子，另一種未能發(fā)生基因重組的蚊子則會直接死掉。這樣以來，雌性不育的性狀就在種群中傳播開來了。

農業(yè)、生態(tài)、醫(yī)學……CRISPR都能干！

微生物的一些代謝物可以被應用于能源、化工和健康等行業(yè)，比如乙醇可以作為燃料，乙烯可以作為合成纖維或橡膠的原料，甘油葡萄糖苷可以作為化妝品的添加劑，因此微生物相當于一座細胞工廠！盡管已經有可以對微生物基因組進行編輯的工具，但是CRISPR的出現(xiàn)可以讓人們更方便地改造微生物。

CRISPR基因編輯技術在農作物的改良方面有廣泛的應用空間，目前全球最大的種子和農藥公司杜邦公司已經開始利用CRISPR基因編輯來對玉米和大豆進行改良，改良的性狀包括耐旱，提高種子的含油量以及耐除草劑等。

再生已滅絕物種是否有意義雖然存在爭議，但是也有科學家正在繼續(xù)研究，在2012年哈佛大學一個由George Church教授領導的團隊就宣稱要通過克隆和基因編輯技術來復活猛犸，他們所用到的基因編輯技術就是CRISPR技術。

在醫(yī)學上， CIRSPR基因編輯技術的應用也令人振奮。源于CRISPR基因編輯的單堿基編輯技術可能治愈上萬種由單堿基突變引起的遺傳疾病。另外，根據(jù)最近在Nature Communication發(fā)表的一項研究，科學家門已經可以利用基于CRISPR的CRISPR激活（CRISPR activation）技術成功的將人類的皮膚成纖維細胞誘導成了誘導型多能干細胞。

一個視頻，了解“上帝的剪刀”

當然，它也是一把雙刃劍

不過，就像很多高新技術一樣，CRISPR在應用上也存在隱患，需要在使用中進行監(jiān)管。

從技術層面上來看，是否存在脫靶效應一直存在著爭議，也就是說在編輯目的基因時可能會對其它不期望編輯的位點也進行編輯。最近發(fā)表在《Nature biotechnology》上的一項研究報告說，利用CRISPR編輯老鼠胚胎干細胞、造血干細胞和人類分化的細胞系時靶標位點也存在明顯的突變，包括大片段的刪除以及復雜的基因組重組，而這些突變可能致病。

另外，發(fā)表在《Nature medicine》上的一項研究聲稱，利用CRISPR對人類多能干細胞進行編輯時，發(fā)現(xiàn)CRISPR引起的雙鏈斷裂能夠引起p53介導的DNA損傷響應，而基因編輯的效率與損傷響應是相沖突的，要想提高編輯的效率需要抑制p53介導的損傷響應，但它被抑制后會增加CRISPR脫靶的概率以及罹患癌癥的風險。

從社會規(guī)范的角度上看，目前已經有不少的黑客在網(wǎng)絡上直播利用CRISPR對自己進行基因編輯，這種做法會對公眾產生誤導，缺乏足夠相關知識的人員盲目效仿可能會對安全造成傷害。

少數(shù)人利用CRISPR對自己進行基因編輯（切勿效仿！ 圖片來源：網(wǎng)絡）

另外從國家安全的角度上來看，各國政府也在關注這項技術的發(fā)展，由于CRISPR基因編輯的低成本以及操作簡單，2016年美國一個國立智庫在向美國參議院提交的一份報告中甚至建議將CRISPR基因編輯技術和朝鮮核試及敘利亞化武一同列到大規(guī)模殺傷性武器的名單中。

結語

CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性是其宿主和病毒及外源質粒長期角力的必然的結果。截至目前，發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)已經多達6類，19種亞型。這些不同類型的免疫系統(tǒng)每次“轉身”所衍生出的新技術都有巨大的潛力。在未來，除了充分利用已經開發(fā)的技術，進一步發(fā)現(xiàn)新型CRISPR-Cas系統(tǒng)、將CRISPR-Cas系統(tǒng)改造成更多的技術以及如何對其進行監(jiān)管和引導都是人們應該努力的方向。

參考文獻：

1. E. V. Koonin, K. S. Makarova, F. Zhang, Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr Opin Microbiol 37, 67-78 (2017).

2. RIDING THE CRISPR WAVE：Biologists are embracing the power of gene-editing tools to explore genomes. Nature ,(2016).

3. N. M. Gaudelli et al., Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464 (2017).

4. K. A. Schaefer et al., Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nature Methods 14, 547 (2017).

5. Jennifer A. Doudna and Samuel H. Sternberg . A crack in creation, (2017).

6. Hammond, A. et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria

mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology 34, 78-83 (2016).

7. N. M. Gaudelli et al., Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464 (2017).

8. Weltner, J. et al. Human pluripotent reprogramming with CRISPR activators. Nature Communications 9, 2643,

(2018).

9. M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to

large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology, (2018).

10. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nature Medicine,

(2018).

11. Gene intelligence. Nature（2016）

12. D. B. Thompson et al., The Future of Multiplexed Eukaryotic Genome Engineering. Acs Chemical Biology,

(2018).

13. D. Chilcoat, Z. B. Liu, J. Sander, Use of CRISPR/Cas9 for Crop Improvement in Maize and Soybean. Prog Mol

Biol Transl Sci 149, 27-46 (2017).